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《mbmp┐4真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)論文》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、mBMP┐4真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)論文.freelBMP-4均由呂振華博士饋贈，EcoRI和HindIII，T4DNA連接酶、溴化乙錠（EB）、RNAase購自華美公司，普通瓊脂糖、脂質(zhì)體（lipofec-tamin）、G418、DMEM購自Gibco公司，胎牛血清購自Hy-clone公司.1.2儀器CO2孵箱，CO2培養(yǎng)箱，低溫冷凍高速離心機(jī)，空氣恒溫?fù)u床，水平電泳儀，TanonGIS凝膠圖像處理系統(tǒng)等.1.3真核表達(dá)載體pcDNA3-mBMP-4的構(gòu)建和鑒定氯化鈣法將pSPT-18-mBMP
2、-4質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞HB101，氨芐青霉素篩選后挑選陽性菌落擴(kuò)增，小量提取mBMP-4質(zhì)粒并用EcoRI和HindIII消化，12gL-1瓊脂糖電泳，鑒定后回收1.3kbmBMP-4片段;采用相同的酶消化pcDNA3質(zhì)粒并回收5.3kb線狀質(zhì)粒片段;采用T4DNA連接酶定向克隆mBMP-4到真核表達(dá)載體pcDNA3中;將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌HB101中并大量擴(kuò)增、回收、純化;EcoRI和HindIII消化新構(gòu)建的質(zhì)粒，12gL－1瓊脂糖凝膠電泳鑒定，使用λDNA/HindIIIma
3、rker，溴化乙錠顯色.1.4真核表達(dá)載體pcDNA3-mBMP-4轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞及其表達(dá)的檢測采用脂質(zhì)體（lipofectamine）轉(zhuǎn)染法將真核表達(dá)載體pcDNA3-mBMP-4轉(zhuǎn)入NIH3T3細(xì)胞內(nèi)（本實(shí)驗(yàn)室凍存），G418（350μgmL-1）篩選轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞;同樣的方法轉(zhuǎn)染pcDNA3質(zhì)粒到NIH3T3細(xì)胞作為空白對照.打點(diǎn)雜交檢測mBMP-4在mRNA水平中的表達(dá).2結(jié)果2.1真核表達(dá)載體pcDNA3-mBMP-4的酶切鑒定EcoRI和HindIII消化pcDNA3-mBMP-4
4、，12gL-1瓊脂糖凝膠中和λDNA/HindIIIMarker一起電泳，溴化乙錠顯色，可見有1.2和5.3kb兩個(gè)電泳條帶，其中前者代表mBMP-4DNA片段，后者代表pcDNA3片段，符合物理圖譜，說明載體構(gòu)建成功（圖1）.2.2mBMP-4在NIH3T3細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體的NIH3T3細(xì)胞在G418篩選的早期表現(xiàn)為大量細(xì)胞死亡，僅少量陽性細(xì)胞生存.陽性細(xì)胞經(jīng)持續(xù)G418篩選和克隆化生長，轉(zhuǎn)染后20d在培養(yǎng)瓶內(nèi)生長到指數(shù)生長期的末期;以后陽性細(xì)胞均在G418篩選下培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)7d后
5、傳代，以后每代均為5～7d傳代一次.打點(diǎn)雜交顯示轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞均為陽性，而轉(zhuǎn)染空白載體的對照組細(xì)胞為陰性.3討論基因轉(zhuǎn)染技術(shù)是將外源基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)并使之在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的技術(shù).早期主要是用來糾正某些遺傳性缺陷性疾病，通過將相關(guān)基因轉(zhuǎn)入缺陷動物體內(nèi)并進(jìn)行表達(dá)來達(dá)到治療目的［1］.隨著基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的發(fā)展，它已經(jīng)不僅用于彌補(bǔ)基因的缺陷，也可用來治療一些常規(guī)性疾病，如在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療中的探索性應(yīng)用［2］.BMP在治療骨折和促進(jìn)骨不連中具有獨(dú)特作用，其家族各成員基因序列已經(jīng)明確，因此，構(gòu)建它們
6、的真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入患者體細(xì)胞內(nèi)，通過在局部表達(dá)BMP并作用于成骨潛能細(xì)胞促進(jìn)骨折愈合成為可能，這將使骨折的治療變的更為簡單.基因治療的關(guān)鍵步驟之一是真核表達(dá)載體的構(gòu)建和能否在細(xì)胞內(nèi)表達(dá).本實(shí)驗(yàn)中所使用的mBMP-4基因和質(zhì)粒pcDNA3中均含有EcoRI和HindIII酶切位點(diǎn)，因此通過定向克隆的方法將mBMP-4和質(zhì)粒pcDNA3連接，亞克隆成為真核表達(dá)載體pcDNA3-mBMP-4，通過將其轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞證明其可在真核細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)，說明該載體構(gòu)建成功.pcDNA3-mBMP-4真核表
7、達(dá)載體的成功構(gòu)建，將為在分子水平研究BMP-4在骨折治療中的作用機(jī)制和BMP與其他因子間的相互作用原理奠定一定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并為將來骨與關(guān)節(jié)的損傷的治療和骨與軟骨的組織工程的研究打下良好的基礎(chǔ).
