構(gòu)建真核表達載體和融合載體經(jīng)驗pcr

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1、此方法可能很多師兄師姐們都在用，只是當時的確沒有找到相關(guān)的詳細說明，學弟再次把自己摸索出來的一點心得寫出來，高手就多多指正，沒做過的就相互學習下，見笑）由于課題組所需，我需要構(gòu)建數(shù)量可觀的真核表達載體和融合載體起初我也查到相關(guān)菌落PCR的文獻，和導師商量，導師一口回絕了他的理由和我所搜集到的理由一樣：假陽性我們實驗室一博士師姐需要做一個真核表達載體挑選了60個菌落，運用目的基因的上下游引物做PCR，出來條帶的有有52個按照經(jīng)驗選取比較亮的14個提取質(zhì)粒，酶切和PCR雙鑒定結(jié)果僅有一個為陽性克隆，其余均為假陽性（假陽性主要考慮來源于未與載體結(jié)合的插入片段）也難怪老板一口回絕只是我需要做的

2、基因太多，最兇猛的時候我一個星期要用兩個200次的TianGen的質(zhì)粒小提，累死人不償命后來我自己對著圖譜研究了一下（我所使用的是pCDNA3.0載體、pCDNA3.1mychisC載體和pEGFP載體）.0的MCS兩端有T7和SP6如果我用T7和SP6作為引物，則1.P出大小約150bp的片段，則為MCS序列，無插入片段2,若有插入片段，則應(yīng)該為目的大小+152bp如下圖所示：后再改進為T7+目的基因下游引物（目的基因-R），或者目的基因上游引物（目的基因-F)+SP6因為即使用T7+SP6證明有插入但也不能確定為目的片段這樣既解決了假陽性也解決了基因的特異性問題如下圖：總結(jié)如下：1

3、.PCR引物的選擇（此點至關(guān)重要，這也是菌液PCR的獨特魅力所在）選擇一個載體上的特異性序列和一個目的基因上的特異性序列作為引物如：pCDNA3.0載體：T7+目的基因-R或SP6+目的基因-FpCDNA3.1mychisC（只有上游T7無下游SP6）：T7+目的基因-RpEGFP（MCS兩側(cè)無通用序列）：自己設(shè)計靠近兩側(cè)的特異性引物（也可以求助于測序公司，如：上海英駿/Invitrogen，他們有絕大多數(shù)載體的測序用的引物序列）仔細的閱讀你的載體圖，選擇針對陽性重組子的特異性引物組合2.菌落的處理（我用的是質(zhì)粒小提，用15ml離心管搖菌，通常加5ml培養(yǎng)基）挑取新鮮菌落于含抗性的（L

4、B）培養(yǎng)基中37°C200rpm搖床搖2-4小時以上（通常趕時間的話我就在搖后3小時做，這時我的PCR循環(huán)數(shù)就要相應(yīng)多些，設(shè)置為32-35個循環(huán)，若不趕時間的話，我都是取搖過夜的活化菌做模板，此時我的PCR循環(huán)數(shù)就相應(yīng)少些，一般28-30個循環(huán)）3.菌液的處理無需特殊處理菌液或取1-2ul菌液稀釋為100倍體積，沸水浴10-15mins甚至于在稀釋體系中按1/1000加triton（這個我沒做過）提出加triton的人說這是為了破膜，以便能夠釋放出帶目的基因的質(zhì)粒，不過我覺得此步驟多次一舉，細胞膜在沸水浴中肯定會變形掉我試過沸水浴15mins，其效果和無需處理的菌液（實際上我在PCR的

5、體系上做了手腳，后述）近似，所以后來我就沒有再那么麻煩的去稀釋，煮沸4.pcr體系：無特殊要求同普通PCR，我一般使用20ul或25ul體系，鑒定用嘛，不用太鋪張，過少的體系也不推薦，除非你很信任你的“槍”和你的加樣的力度5.模板的量：1-2ul未處理的和處理過的菌液均可以加1-2ul作為模板，需要說明的是PCR的反應(yīng)是一個微量反應(yīng)，用于檢測10的負3-6次方級別，如果用未做任何處理的菌落來做PCR其量過于大，菌落通常都是10的6次方級別（因為我看到最近有一帖是一位仁兄直接用菌落做模板，我沒有做過驗證，但從原理上來說是不推薦的）6.退火溫度：55-58°C此步我沒有詳細的論證，因為我的

6、目的基因我都做過梯度PCR，其退火溫度均可以用55°C或者58°C完成T7，SP6的退火溫度400-900bp的產(chǎn)物大概為55°我也有62度為最佳退火溫度的產(chǎn)物，但是用T7+目的基因-R在58°C和55°C均可以P出目的條帶7.循環(huán)數(shù)：取決于模板的拷貝數(shù)，最少的我試過28個，最多的也不過35個，均可以P出來8.預(yù)變形時間：因為嫌稀釋菌液煮沸的過程很麻煩，所以后來我就直接取的活化菌液，考慮到的確可能細胞膜變形不完全，導致擴增的模板未能完全釋放，以致擴增效率降低，我將預(yù)變形的時間改為10-15mins，效果不錯，之前煮沸過的菌液自然不需要考慮這一步以上就是學弟的一點個人經(jīng)驗，絕大部分經(jīng)過自

7、己的驗證，如有覺得不妥的地方還請大家多多指正！再次高呼：菌液PCR在陽性克隆的篩選中異常的方便和廉價，高度推崇?。?！P.S.通過長時間的魔鬼試驗進程，我現(xiàn)在基本可以做到用肉眼高精度的識別菌落，一般挑取的菌落90%以上均為陽性菌落，所以這篇文章暫時定位于小鳥級別的分生試驗者，老鳥。。。嘿嘿，那就不用了，給大家看一張后來我做的菌液PCR的圖：這張圖上共有4個基因的重組子除了第二個基因的第二個泳道有非特異性的產(chǎn)物，其他均為目的條帶補充說明如下：鑒于很