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1、雞體抗傳染性法氏囊病病毒天然免疫基因的miRNA調(diào)控機(jī)制傳染性法氏囊病(InfectiousBursalDisease,IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(InfectiousBursalDiseaseVirus,IBDV)引起的一種高度危害養(yǎng)雞業(yè)的傳染病。天然免疫(innateimmunity)是機(jī)體防御病原體感染的第一道防線,在啟動(dòng)機(jī)體的獲得性免疫應(yīng)答中起著十分重要的作用。microRNA(miRNA)是一種21-25nt的小分子RNA,是基因表達(dá)的調(diào)控子,本研究以IBDV為模式病毒,探討了miRNA在機(jī)體中調(diào)控干擾素、p53和模式識(shí)別受體抗IBDV天然
2、免疫的分子機(jī)制。1傳染性法氏囊病病毒對(duì)雞法氏囊組織中干擾素和p53轉(zhuǎn)錄的影響為了分析傳染性法氏囊病病毒(IBDV)感染雞體內(nèi)干擾素和p53轉(zhuǎn)錄水平差異變化,用IBDV弱毒(B87)和強(qiáng)毒(QL/12)分別感染4周齡SPF雞,每隔12h時(shí)(12～84h)取3只雞的法氏囊組織混合勻漿,用熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)檢測(cè)其感染前后干擾素(IFN)和p53的mRNA水平,同時(shí)分析法氏囊組織的病理變化和病毒載量。結(jié)果顯示:QL/12組,IFN-αα和IFN-βmRNA水平隨著時(shí)間的增加逐漸升高,48h達(dá)到峰值,隨后降低;IFN-γmRNA水平隨著時(shí)間的增
3、加逐漸升高,60h達(dá)到峰值,隨后逐漸降低;p53mRNA含量迅速升高,60h達(dá)到峰值(比正常SPF雞高約90倍),隨后降低。B87組,IFN-αmRNA水平先降低后升高(48h達(dá)到最低值),而IFN-βmRNA水平變化不規(guī)則,72h含量最高;IFN-ymRNA水平先逐漸升高后降低(72h達(dá)到峰值);p53mRNA含量變化較小,36h含量最高(比正常SPF雞高約5倍);QL/12組誘導(dǎo)法氏囊組織產(chǎn)生的IFNmRNA(IFN-α、IFN-β和IFN-γmRNA)以及p53mRNA水平均顯著高于B87-IBDV組。病理組織學(xué)檢查可見(jiàn):與正常對(duì)照組相比,QL/1
4、2組法氏囊淋巴濾泡呈不同程度的損傷,B87組法氏囊組織未見(jiàn)明顯的組織病變。qRT-PCR檢測(cè)IBDV病毒載量,QL/12組法氏囊組織中病毒含量48h達(dá)到峰值(8.4×106copies/mg),而B87組法氏囊組織中病毒含量72h達(dá)到峰值(6.6×104copies/mg)。本研究為分析雞體內(nèi)IFN和p53介導(dǎo)的抗IBDV天然免疫中的作用奠定了基礎(chǔ)。2雞p53抑制傳染性法氏囊病病毒復(fù)制及gga-miR-2127對(duì)其調(diào)控機(jī)制傳染性法氏囊病(InfectiousBursalDisease,IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(InfectiousBursalDis
5、easeVirus,IBDV)引起的一種高度危害養(yǎng)雞業(yè)的傳染病。腫瘤抑制蛋白p53能夠抑制多種病毒的復(fù)制,但對(duì)IBDV復(fù)制的影響仍然不清楚。本研究以IBDV為模式病毒,采用體外感染模式,在IBDV感染的DF-1細(xì)胞中,p53的表達(dá)水平和活性均顯著升高。p53過(guò)表達(dá)可以抑制IBDV的復(fù)制,并激活雞體抗病毒天然免疫基因(IPS-1、IRF3、PKR、OAS、Mx)的表達(dá)水平上調(diào);p53抑制表達(dá)則得到相反的結(jié)果;表明p53可以激活雞體的抗病毒天然免疫反應(yīng)發(fā)揮抗IBDV感染作用。用生物信息學(xué)方法和雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)gga-miR-2127可以作用于p53
6、的3’UTR;qRT-PCR和免疫印跡分析表明gga-miR-2127可以使p53的蛋白水平表達(dá)降低,但mRNA水平?jīng)]有變化;gga-miR-2127過(guò)表達(dá)可以使雞體的抗病毒天然免疫基因表達(dá)降低,IBDV復(fù)制水平升高。本研究表明:gga-miR-2127可以作用于p53的3’UTR調(diào)控p53的表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗IBDV感染的作用。3gga-miR-9*靶向IRF2促進(jìn)傳染性法氏囊病病毒復(fù)制的分子機(jī)制為研究gga-miR-9*對(duì)傳染性法氏囊病病毒(IBDV)復(fù)制的影響,本研究用化學(xué)合成的方法合成gga-miR-9*的模擬物gga-miR-9*mimics,轉(zhuǎn)染D
7、F-1細(xì)胞,24h后,接種IBDV,48h后,收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液,測(cè)定IBDV的滴度,結(jié)果顯示,gga-miR-9*mimics能夠促進(jìn)IBDV的復(fù)制。通過(guò)對(duì)病毒感染后的IFN檢測(cè)分析,發(fā)現(xiàn)gga-miR-9*可負(fù)調(diào)控干擾素(IFN)的產(chǎn)生;進(jìn)一步用生物信息學(xué)方法和雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析驗(yàn)證,gga-miR-9*可靶向調(diào)控干擾素調(diào)控基因2(IRF2)。用westernblot和qRT-PCR分析,gga-miR-9*mimics轉(zhuǎn)染的DF-1細(xì)胞中IRF2蛋白和mRNA水平均比正常DF-1細(xì)胞顯著降低,將細(xì)胞中的IRF2基因敲除,IBDV復(fù)制滴度((10
8、625TCID50/0.1mL))顯著高于miRNA對(duì)照組((10525TCID
