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1、廣西北斗星動物保健品有限公司操 作 標(biāo) 準(zhǔn)頁碼:4/4文件編碼:SOP-81021版本號:01 題目:鈷60輻照滅菌生物指標(biāo)菌(生孢梭菌)使用SOP1.目的:建立鈷60輻照滅菌生物指標(biāo)菌——生孢梭菌CMCC(B)64941的使用規(guī)程,保證正確使用,對鈷60輻照滅菌效果進行驗證。2.適用范圍:適用于用鈷60輻照滅菌生物指標(biāo)菌——生孢梭菌CMCC(B)64941對鈷60輻照滅菌效果進行的監(jiān)測。3.職責(zé):鈷60輻照滅菌操作人員、QA人員、QC微生物檢驗員對本標(biāo)準(zhǔn)的實施負責(zé)。4.方法:4.1生孢梭菌作為供試品無菌檢查的厭氧對照菌。4.2培養(yǎng)基的制備4.2.1營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基胨10.0g,氯化鈉5.0
2、g,牛肉浸出粉3.0g,水1000mL。取上述成分混合,微溫溶解,調(diào)節(jié)pH為弱堿性,煮沸,濾清,調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.2±0.2,分裝,滅菌。4.2.2營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基按上述4.2.1營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的處方及制法,加入14.0g瓊脂,調(diào)節(jié)pH使滅菌后為7.2±0.2,分裝,滅菌。4.2.3硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基(用于培養(yǎng)好氧菌、厭氧菌)酪胨(胰酶水解)15.0g,氯化鈉2.5g,葡萄糖5.0g,新配制的0.1%刃天青溶液1.0mL,硫乙醇酸鈉(或硫乙醇酸0.3mL)0.5g,L-胱氨酸0.5g,瓊脂0.75g,酵母浸出粉5.0g,水1000mL。廣西北斗星動物保健品有限公司操 作 標(biāo) 準(zhǔn)頁碼:4
3、/4文件編碼:SOP-81021版本號:01 題目:鈷60輻照滅菌生物指標(biāo)菌(生孢梭菌)使用SOP除葡萄糖和刃天青溶液外,取上述成分混合,微溫溶解,調(diào)節(jié)pH為弱堿性,煮沸,濾清,加入葡萄糖和刃天青溶液,搖勻,調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.1±0.2。分裝至適宜的容器中,其裝量與容器高度的比例應(yīng)符合培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基氧化層(粉紅色)不超過培養(yǎng)基深度的1/2。滅菌。在供試品接種前,培養(yǎng)基氧化層的高度不得超過培養(yǎng)基深度的1/5,否則,須經(jīng)100℃水浴加熱至粉紅色消失(不超過20分鐘),迅速冷卻,只限加熱一次,并應(yīng)防止被污染。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基置30~35℃培養(yǎng)。4.2.3改良馬丁培養(yǎng)基(用于培養(yǎng)真菌)
4、胨5.0g,磷酸氫二鉀1.0g,酵母浸出粉身碎骨2.0g,硫酸鎂0.5g,葡萄糖20.0g,水1000mL。除葡萄糖外,取上述成分混合,微溫溶解,調(diào)節(jié)pH值約為6.8,煮沸,加入葡萄糖溶解后,搖勻,濾清,調(diào)節(jié)節(jié)pH值使滅菌后為6.4±0.2,分裝,滅菌。改良馬丁培養(yǎng)基置23~28℃培養(yǎng)。4.3菌液的制備接種生孢梭菌新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中,30~35℃培養(yǎng)18~25小時,培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1mL含菌數(shù)小于100cfu(菌落形成單位)的菌混懸液。4.4稀釋液、沖洗液及其制備方法4.4.10.1%蛋白胨水溶液取蛋白胨1.0g,加水1000mL,微溫溶解,濾清,調(diào)節(jié)pH
5、值至7.1±0.2,分裝,滅菌。4.4.2pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液取磷酸二氫鉀3.56g、磷酸氫二鈉7.23g、氯化鈉4.30g、蛋白胨1.0g、加水1000mL,微溫溶解,濾清,分裝,滅菌。4.6供試品的無菌檢查取本品4瓶,每瓶取10mL,混勻,取25mL轉(zhuǎn)移至250ml含1%聚山梨酯-80的0.1%無菌蛋白胨溶液中,充分振搖使其分散,加入β-內(nèi)酰胺酶溶液(每1廣西北斗星動物保健品有限公司操 作 標(biāo) 準(zhǔn)頁碼:4/4文件編碼:SOP-81021版本號:01 題目:鈷60輻照滅菌生物指標(biāo)菌(生孢梭菌)使用SOPmg鹽酸頭孢噻呋加頭孢菌素酶不得少于1000單位),充分振搖,置37℃水浴中
6、加熱1小時后,取出,按如下方法進行檢查。取上述處理過的樣品10mL接種至各含硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基的容器中。除另有規(guī)定外,每個容器中培養(yǎng)基的用量應(yīng)符合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%,同時,硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于15mL,改良馬丁培養(yǎng)基每管裝量不少于10mL。每種培養(yǎng)基接種的管數(shù)同供試品的檢驗數(shù)量。4.5培養(yǎng)及觀察上述含培養(yǎng)基的容器按規(guī)定的溫度培養(yǎng)14日,培養(yǎng)期間應(yīng)逐日觀察并記錄是否有菌生長。如在加入供試品后,或在培養(yǎng)過程中,培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁,培養(yǎng)14日后,不能從外觀上判斷有無微生物生長,可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基中或劃線接種于斜面培養(yǎng)基上,細菌培
7、養(yǎng)2日,真菌培養(yǎng)3日,觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁或斜面是否有菌生長;或取培養(yǎng)液涂片,染色,鏡檢,判斷是否有菌。1.結(jié)果判斷若供試品管均澄清,或雖顯渾濁但經(jīng)確證無菌生長,判供試品符合規(guī)定;若供試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長,判供試品不符合規(guī)定,除非能充分證明試驗結(jié)果無效,即生長的微生物非供試品所含。當(dāng)符合下列至少一個條件時,方可判斷試驗結(jié)果無效:⑴無菌檢查試驗所用的設(shè)備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不