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1、體外抗菌藥物抑菌試驗-劉長秀一、概念藥物敏感試驗是在體外檢測抗菌藥物對細(xì)菌的抑制和殺滅的作用。根據(jù)藥物的常規(guī)劑量在體內(nèi)所能達(dá)到的濃度對細(xì)菌的影響，將被檢菌株對該藥的敏感程度分為三級：敏感、中度敏感／中介度、耐藥。二、藥敏試驗的常用方法K-B紙片擴散法、肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法及E-test法試驗前面講過藥物對同一菌株，MIC值越小，其抗菌力就越強，K-B法的抑菌圈(環(huán))就越大，細(xì)菌對這種藥物就越敏感，這是K-B紙片擴散法與稀釋法的關(guān)系，呈負(fù)相關(guān)。（一）K-B紙片擴散法是由Kirby和Bauer所創(chuàng)建，此方法屬定性試驗，是藥敏試驗中最成熟的方法之一，但操作時影響因素較
2、多，需注意質(zhì)控。經(jīng)世界衛(wèi)生組織推薦統(tǒng)一實驗條件，規(guī)定了統(tǒng)一用水解洛蛋白培養(yǎng)基及平板大小，培養(yǎng)基厚度，標(biāo)準(zhǔn)菌株、菌齡及菌濃度，操作手法，紙片質(zhì)量及厚度，藥敏紙片之間距離，觀察量取結(jié)果時間及工具，為各國廣泛采用的方法。根據(jù)本國國情，衛(wèi)生部臨床檢驗中心還制訂了關(guān)于臨床微生物實驗室室內(nèi)質(zhì)控要求。臨床具體工作須參照遵守。原理是將定量抗菌藥物紙片貼在涂有細(xì)菌的瓊脂平板上，抗菌藥物在瓊脂內(nèi)向四周擴散，其濃度逐漸遞減，使紙片周圍的敏感細(xì)菌受到抑制生長，形成抑菌圈，測量抑菌圈的直徑來判定細(xì)菌對藥物的敏感程度。此法簡單易行、價格便宜、藥物選擇靈活，適用對生長快的細(xì)菌進(jìn)行藥敏試驗。1水
3、解酪蛋白瓊脂（Mueller-HintonAgarMHA）傾注成4mm厚的12～15cm平板，將其保存于4℃冰箱可用1周。2硫酸鋇比濁管1.175%氯化鋇（BaCl2.2H2O）0.5ml加0.36N(1%)流酸溶液99.5ml,充分混勻，每管4ml其濁度相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)希∕cFarlandstandard）比濁管第一管1/2（1.5億/ml相當(dāng)于1.5×108CFU／m1）,使用期半年。材料3抗菌素紙片現(xiàn)有商品（阿米卡星(AMK)、慶大霉素(GEN)、青霉素(PEN)、苯唑西林(OXA)、氨芐西林(AMP)、氨芐西林／舒巴坦(AMS)、呢拉西林(PIP)、頭抱唑
4、林(FZN)、頭孢呋辛(FRX)、頭孢他啶(CAZ)、氨曲南(ATM)、亞胺配南(1MP)、環(huán)丙沙星(CIP)、萬古霉素(VAN)、克林霉素(CLI)、復(fù)方新諾明(SXT)4質(zhì)控菌金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、大腸埃希菌（ATCC25922）5其它無菌生理鹽水、無菌棉拭、鑷子、游標(biāo)毫微米卡尺、消毒小試管、1ml、10ml吸管。操作方法1將金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌先接種在血平板或營養(yǎng)平板上，37℃孵育16～24h。2再將菌落接種至營養(yǎng)肉湯中，培養(yǎng)4～6小時后用滅菌生理鹽水校正菌液濃度至0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管(相當(dāng)于1.5×108CFU／m1)。3用滅菌棉拭子
5、蘸取相當(dāng)于1.5×108CFU/m1的金黃色葡萄球菌菌液，在試管內(nèi)壁旋轉(zhuǎn)擠去多余菌液后，在MHA平板表面上，從不同方向均勻涂布3次，每次旋轉(zhuǎn)平板60度，最后沿平板內(nèi)緣涂抹1圈。同樣方法涂布大腸埃希菌。平板在室溫下干燥3～5min后。根據(jù)試驗菌株選擇抗菌譜。如陽性球菌:金黃色葡萄球菌選擇青霉素(PEN)、苯唑西林(OXA)環(huán)丙沙星(CIP)、萬古霉素(VAN)、克林霉素(CLI)等。大腸埃希菌選用氨芐西林(AMP)、頭抱唑林(FZN)、慶大霉素(GEN)、環(huán)丙沙星(CIP)、亞胺配南(IMP)等。用無菌鑷子將含藥紙片，緊貼于瓊脂表面，各紙片之間相距應(yīng)大于24mm，紙
6、片距平板內(nèi)緣應(yīng)大于15mm，置37℃孵育18h～24h觀看結(jié)果。結(jié)果紙片周圍的細(xì)菌受抑制，形成明顯的抑菌圈，用游標(biāo)卡尺測量抑菌環(huán)直徑的大小記錄之。參考表中的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，報告敏感(S)、耐藥(R)。注意事項標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌圈應(yīng)落在表中所示的預(yù)期范圍內(nèi)。如果超出該范圍，應(yīng)視為失控，須及時查找原因，予以糾正。培養(yǎng)基的質(zhì)量、藥敏紙片的質(zhì)量、接種菌量、試驗操作質(zhì)量、孵育條件、抑菌圈測量工具的精度、質(zhì)控菌株的藥敏特性等均能影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。（二）肉湯稀釋法及瓊脂稀釋法原理是用水解酪蛋白肉湯(MH)或水解酪蛋白瓊脂（MHA）培養(yǎng)基作為稀釋劑。按《美國委員會臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)》作分步
7、倍比稀釋抗菌藥物，定量加入被檢菌株。經(jīng)培養(yǎng)后觀察抗菌藥物的最小抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)。優(yōu)缺點稀釋法是直接定量地檢測抗菌藥物在體外對病原菌的抑制或殺滅濃度，有利于臨床根據(jù)MIC、藥物代謝等擬定合理的治療方案，是目前厭氧菌的最佳測定方法，瓊脂稀釋法還易于發(fā)現(xiàn)污染或耐藥突變菌。稀釋法是新藥開發(fā)，體外藥敏試驗常用的經(jīng)典參照標(biāo)準(zhǔn)，但操作相對比較煩瑣。材料（肉湯稀釋法）標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25923、待測菌株（金黃色葡萄球菌6h菌液）MH肉湯、頭孢霉素或青霉素注射粉劑、無菌蒸餾水、0.1mol/L消毒磷酸鹽緩沖液、0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管(相當(dāng)于1.5×108CF
8、U/m1)
