gbt 28099-2011 水稻細菌性條斑病菌的檢疫鑒定方法

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1、ICS65．020．01B16蝠園中華人民共和國國家標準GB／T28099--2011水稻細菌性條斑病菌的檢疫鑒定方法DetectionandidentificationofXanthomonasoryzaepv．oryzicDf口(Fangeta1．)Swingseta1．2011-12-30發(fā)布2012—06—01實施宰瞀徽紫瓣訾糌瞥星發(fā)布中國國家標準化管理委員會廈19月U吾GB／T28099--2011本標準按照GB／T1．1--2009給出的規(guī)則起草。本標準由全國植物檢疫標準化技術委員會(SAC／TC271)提出并歸口。本標

2、準起草單位：中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局、中華人民共和國廈門出入境檢驗檢疫局、中華人民共和國江蘇出入境檢驗檢疫局、中華人民共和國重慶出入境檢驗檢疫局、南京農業(yè)大學。本標準主要起草人：易建平、林石明、周國粱、粟寒、印麗萍、孔德英、許志剛、胡白石。1范圍水稻細菌性條斑病菌的檢疫鑒定方法本標準規(guī)定了水稻細菌性條斑病菌的檢測和鑒定方法。本標準適用于水稻種子及植株上水稻細菌性條斑病菌的檢測與鑒定。2規(guī)范性引用文件GB／T28099--201下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日

3、期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。SN／T0800．1進出口糧油、飼料檢驗抽樣和制樣方法SN／T2122進出境植物及植物產品檢疫抽樣3水稻細菌性條斑病菌基本信息中文名：水稻細菌性條斑病菌(稻黃單胞菌稻生致病變種)。學名：Xanthomonasoryzaepv．oryzicola(Fangeta1．，1956)Swingseta1．，1990，簡稱Xoc。異名：Xanthomonascampestrispv．oryzicola(Fangeta1．，1956)Dye1978；Xanthomonasoryzicol

4、a(Fangeta1．，1956)Dowson1943；Xanthomonastranslucensf．sp．oryzicola(Fangeta1．，1956)Bradbury1971。病害英文名：bacterialleafstreakofrice。屬細菌界Bacteria，變形細菌門Proteobacteria，7變形細菌綱Gammaproteobacteria，黃單胞菌目Xanthon∞nodales，黃單胞菌科Xanthomonodaceae，黃單胞菌屬Xanthomonas(Dowson，1939)。病菌主要在病種子和病草上

5、越冬，其次在水稻再生苗或李氏禾等雜草上越冬。病菌主要借雨水、流水等傳播，帶菌種子是遠距離傳播的主要途徑之一。水稻細菌性條斑病菌的其他信息參見附錄A。4方法原理根據癥狀特征、菌落形態(tài)特征、生理生化特征、PCR反應和致病性測試結果等進行檢測鑒定。5主要試劑除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純或生化試劑。三羥甲基胺基甲烷鹽酸鹽(Tris—HCl)、乙二胺四乙酸(EDTA)、十二烷基硫酸鈉(sDs)、十六烷基三甲基溴化胺(cTAB)、三氯甲烷、異戊醇、乙醇、蛋白酶、溴化乙錠、酵母粉、瓊脂、蛋白胨、牛肉浸膏、營養(yǎng)肉湯、葡萄糖、蔗糖、谷氨酸鈉。培養(yǎng)

6、基和試劑配方見附錄B。1GB／T28099--2016儀器用具超凈工作臺、高壓滅菌鍋、生物顯微鏡、培養(yǎng)箱、電子天平、冰箱、離心機、水浴鍋、培養(yǎng)皿、三角瓶、剪刀、電泳儀、PCR儀、凝膠成像系統、BIOLOG微生物鑒定系統、微量可調加樣器和離心管。7檢測與鑒定7．1現場檢疫按照SN／T2122和sN／T0800．1規(guī)定的程序進行現場檢疫并抽取樣品。7．2實驗室檢測7．2．1有癥葉片的分離有癥葉片用無菌水沖洗后取病斑前沿2mm～7mm部分用70％酒精表面消毒15s，無菌水洗三次后用無菌剪刀剪碎，置于無菌載玻片上，加一滴無菌水，不加蓋玻片，

7、置于顯微鏡下觀察噴菌現象，如觀察到噴菌現象，從噴菌處用接種環(huán)取一環(huán)處理液在NA(PsA或NBY)培養(yǎng)基平板上劃線分離，重復3個平板，27℃培養(yǎng)3d～5d。7．2．2無癥葉片的分離取10張無癥葉片，剪碎研磨后提取DNA，進行PCR檢測，DNA提取程序和PCR檢測程序見附錄c。陽性樣品進行病菌分離。另取無癥葉片10張，無菌水沖洗葉面，70％酒精表面消毒15s，無菌水洗三次后用無菌剪刀剪碎，加入適量無菌水，靜置15rain，用接種環(huán)取處理液在NA(PSA或NBY)培養(yǎng)基平板上劃線分離，重復3個平板，27℃培養(yǎng)3d～5d。7．2．3從種子中

8、分離種子處理液在培養(yǎng)基上富集后進行PCR檢測，100g種子磨碎后置于200mL含有0．01％Tween20的無菌水中4℃過夜，取100pL處理液在PSA培養(yǎng)基平板上涂布，重復3個平板，27℃培養(yǎng)2d，每個平板用1mL無菌水洗下，取洗板