gbt 28078-2011 水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌檢疫鑒定方法

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1、ICS65．020．01B16a亙中華人民共和國國家標準GB／T28078--2011水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌檢疫鑒定方法DetectionandidentificationofXanthomonasoryzaepv．oryzae(Ishiyama)Swingseta1．、Xanthomonasoryzaepv．oryzicola(Fangeta1．)Swingseta1．2011—12—30發(fā)布2012—06—01實施宰瞀鵲鬻瓣警矬瞥星發(fā)布中國國家標準化管理委員會“”。刖昌GB／T28078--2011本標準按照GB／T1．12

2、009給出的規(guī)則起草。本標準由全國植物檢疫標準化技術(shù)委員會(SAC／TC271)提出并歸口。本標準起草單位：中華人民共和國湖南出入境檢驗檢疫局、中國檢驗檢疫科學(xué)研究院、中華人民共和國廈門出入境檢驗檢疫局。本標準主要起草人：朱金國、趙文軍、唐連飛、朱水芳、莫瑾、彭梓、陳紅運、鐘文英。1范圍水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌檢疫鑒定方法GB／T28078—2011本標準規(guī)定了水稻種子和其他水稻材料的水稻白葉枯病菌Xanthomonasoryzaepv．oryzae(Xoo)和水稻細菌性條斑病菌Xanthomonasoryzaepv．oryzic

3、ola(Xcola)的檢疫鑒定以植物的形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性、分子生物學(xué)和酶聯(lián)免疫學(xué)技術(shù)作為依據(jù)，明確了田問觀察、分離鑒定、樣品保存的方法。本標準適用于水稻材料和相關(guān)環(huán)境中水稻自葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌的檢測。2規(guī)范性§f用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注El期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB15569--1995農(nóng)業(yè)植物詞運檢疫規(guī)程ISTA國際種子檢驗規(guī)程3方法原理根據(jù)水稻植株的形態(tài)學(xué)特征進行田問觀察，并采用分離培養(yǎng)、分子生物學(xué)和酶聯(lián)免疫

4、學(xué)篩選、生理生化鑒定以及致病性測定對植株材料上的水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌進行判定。4設(shè)備和材料4．1冷凍高速離心機：轉(zhuǎn)速≤15000r／rain。4．2PCR擴增儀。4．3恒溫培養(yǎng)箱：28℃±1℃。4．4顯微鏡：物鏡頭10×～100×。4．5天平：精度0．001g。4．6高壓滅菌器。4．7均質(zhì)器：轉(zhuǎn)速4000r／min～8000r／rain。4．8可調(diào)移液器：0．2pL～1pL，1pL～lopL，10pL～100pL，100pL～1000肛L。4，9器具：滅菌的鑷子、剪刀，稱量勺。4．10吸管：1mL、10mL。4．11滅菌平皿：

5、直徑90mm，玻璃或一次性塑料平皿。4．12三角瓶：i00mL。5培養(yǎng)基和試稠5．1SPA培養(yǎng)基：見A．1。GB／T28078--20115．20．001％吐溫20一磷酸鹽緩沖液。5．3革蘭氏染色試劑：見A．2。5．4鞭毛染色試劑：見A．3。5．5明膠液化培養(yǎng)基：見A．4。5．6氧化酶試劑：見A．5。5．7硝酸鹽培養(yǎng)基：見A．6。5．8過氧化氫酶試驗試劑：見A．7。5．9石蕊牛乳試劑：見A．8。5．10糖氧化和發(fā)酵測定培養(yǎng)基：見A．9。5．11碳源利用試驗培養(yǎng)基：見A．10。5．12水楊苷產(chǎn)酸試驗培養(yǎng)基：見A．1l。5．132，3，5-三苯

6、基氯化四氮唑(TTC)。6田問檢驗水稻在整個生育期的葉片均可受害，在苗期、分蘗期受害最重，通過田間觀察可直接對水稻受害情況進行判斷，水稻細菌性條斑病菌和水稻白葉枯病菌田間癥狀及相關(guān)資料參見附錄B和附錄c。對田間檢驗有病害發(fā)生的植株，按以下操作進行抽樣及實驗室檢驗。7抽樣水稻種子抽樣可參照IsTA《國際種子檢驗規(guī)程》或者GP,15569--19956．1方法進行。8樣品處理8．1水稻種子大量種子樣品通常需先用蒸餾水沖洗以除去殘片和表面的污染雜茵，以避免雜菌太多產(chǎn)生干擾。清洗后稱取10g或400粒種子，放人0．001％吐溫一磷酸緩沖液中低溫(5

7、℃～15℃)浸泡4h～6h，用均質(zhì)器打碎，制備樣品提取液。如果是檢測少量的種子樣品，取20粒種子加入i0mL滅菌的磷酸緩沖液，用滅菌槌和研缽或是攪拌器將種子完全壓碎制成提取液。將樣品提取液于22℃～25℃環(huán)境中放置4h～6h。旋渦混勻懸浮液5min，制備10×、i00×和1000×三個稀釋度的懸浮液，從原液及每個梯度稀釋液中取0．3mL，分別放人到3個SPA的平皿中(每個平皿加入0．1mL)。用L-型玻璃棒將液體均勻涂布在SPA瓊脂的表面。若提取液雜菌較多，可考慮增加稀釋梯度和接種平板的數(shù)量以提高檢出率。8．2植物組織材料8．2．1無癥狀的

8、組織可將10g左右樣品直接放人90mL0．001％吐溫一磷酸鹽緩沖液中，均質(zhì)imin制備成樣品提取液。按8．1方法進行稀釋與涂布。8．2．2未顯癥的可疑組織用滅菌的剪刀剪成小塊，