143、糖化酶菌種崗位標準操作規(guī)程

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1、SOPIPC14300第8頁共8頁生產(chǎn)標準操作和管理程序起草：日期：標準操作程序－－過程控制程序?qū)徍耍喝掌冢禾腔妇N崗位標準操作規(guī)程批準：日期：SOPIPC14300執(zhí)行日期：簽名：變更記載：修訂號批準日期執(zhí)行日期變更原因及目的：發(fā)放部門：生產(chǎn)部品質(zhì)管理部發(fā)酵車間SOPIPC14300第8頁共8頁1、目的：建立糖化酶生產(chǎn)種子崗位操作規(guī)程，使種子工嚴格操作，確保種子質(zhì)量及無菌。2、適用范圍：適用于種子崗位。3、責任者：種子操作人員。4、正文：1.菌種工藝流程：甘油管→淀粉平板→半干體→種子搖瓶→種子罐原始菌種先接入淀粉平板→半干體純化后由半干體接入甘油管

2、.2.培養(yǎng)基制備：2.1甘油管制備：在50或100ml三角瓶中配置50%濃度的甘油乳液，121℃，0.11Mpa40分鐘滅菌2次，放無菌室備用，備用期不能超過10天。如果已經(jīng)使用過，在下次使用時仍需滅菌；用玻璃小試管（10×100）或塑料小試管洗凈烘干，121℃，0.11Mpa40分鐘滅菌2次后備用；糖化酶用半干體做甘油管，即在無菌條件下吸取1-2ml半干體于小試管內(nèi)，同時吸取等量備用50%的甘油于小試管中，塞好膠塞，充分搖勻。此時的甘油濃度為20%或略高，如果濃度太高不能冷凝，太低細胞容易破碎不能保藏。一般情況放入-80℃冰箱保藏半年或一年，時間不能太

3、長。2.2淀粉平板的制備：淀粉培養(yǎng)基(淀粉平板)蛋白胨1.0%酵母粉0.2%牛肉粉0.3%NaCL0.2%玉米淀粉1.0%瓊脂粉1.7%稱量完畢后定容到所需體積，用稀鹽酸調(diào)PH到5.8-6.1，煮沸使瓊脂溶解，121℃、30分鐘滅菌，冷卻到50℃倒平板，每皿20-25ml。分離時用移液管吸取0.1ml-0.2ml半干體種子涂布于培養(yǎng)基中,33±1℃，培養(yǎng)4-5天.技術要求:單菌落要多,呈褶皺,盆地狀.2.3察氏平板的制備:蔗糖3%硝酸鈉0.2%磷酸氫二鉀0.1%MgSO47H2O0.05%FeSO47H2O0.001%KCL0.05%瓊脂粉1.7%SOP

4、IPC14300第8頁共8頁稱量完畢后定容到所需體積，用稀鹽酸調(diào)PH到5.8-6.1，煮沸使瓊脂溶解，121℃、30分鐘滅菌，冷卻到50℃倒平板，每皿18-20ml。將淀粉平板中典型菌落涂布于培養(yǎng)基中,33±1℃培養(yǎng)4-5天.技術要求:菌苔厚,無雜菌污染,灰色帶紅2.4半干體培養(yǎng)基蔗糖3%硝酸鈉0.2%磷酸氫二鉀0.1%MgSO4.7H2O0.05%FeSO4.7H2O0.001%KCL0.05%瓊脂粉0.05%稱量完畢后定容到所需體積，用稀鹽酸調(diào)PH到5.8-6.1，煮沸使瓊脂溶解，121℃、30分鐘滅菌，將察氏平板中典型菌苔刮入培養(yǎng)基中,34℃培養(yǎng)4

5、-5天.培養(yǎng)期間每天每6小時順時針搖3-4圈。2.5種子搖瓶制備:豆餅粉2%玉米漿2%玉米淀粉12%高淀0.05%豆粉單獨稱量倒入瓶中,玉米淀粉加熱煮沸液化10分鐘,每瓶裝量150ml/500ml,121℃、40分鐘滅菌.將半干體在無菌條件下吸入10-15ml.上搖床,轉(zhuǎn)速300轉(zhuǎn)/分鐘,33-34℃培養(yǎng)2-3天.3.火焰保護法接種小罐3.1準備工作，酒精棉球一瓶，鑷子、火柴、噴霧器。3.2小罐接種：罐溫降至32℃時，用75%酒精棉球消毒接種口及用5%石碳酸噴霧消毒小罐周圍的空氣，然后在小罐接種口點燃酒精棉滅菌，關閉接種葫蘆靠罐閥,擰開接種帽,不要將其拿

6、出火焰保護范圍,,將裝有種液的搖瓶在火焰保護下迅速倒入接種葫蘆內(nèi),擰上接種帽.打開靠罐閥,調(diào)整罐壓使之升到0.08MPa，再緩慢降至0.03MPa，反復數(shù)次，利用壓差法將種液接入罐內(nèi).4.無菌試驗4.1固體、液體細菌培養(yǎng)基的制備方法原料名稱固體配方（%）液體配方（%）SOPIPC14300第8頁共8頁葡萄糖--0.3牛肉膏0.50.3蛋白胨0.61.0氯化鈉0.50.5酚紅--0.4瓊脂2.0—2.2--PH7.0—7.27.0—7.24.2固體培養(yǎng)基的配制4.2.1稱取牛肉膏，蛋白胨于燒杯中，加適量水、加熱攪勻溶解后加至需要量水，然后用10%NaOH調(diào)

7、節(jié)PH值(用PH計測定)。4.2.2將調(diào)好PH值的固體培養(yǎng)基分裝在三角瓶中(1000ml瓶裝量200ml)加瓊脂，包扎好消毒，壓力為0.10─0.11MPa溫度121±1℃，時間30分鐘。4.2.3消毒后的固體培養(yǎng)基自然冷卻至50℃左右在無菌條件下倒碟，每支雙碟裝量20─25ml不易太厚或太薄，凝固移入恒溫室培養(yǎng)24--48小時，檢查無菌方可使用。5取無菌樣5.1種子罐每隔8小時取無菌樣一次，劃無菌平板2個。大罐每8小時取一次、劃無菌平板2個。補料罐每4小時取無菌樣一次.劃無菌平板2個。5.2用75%酒精棉擦凈取樣試管壁外沿的發(fā)酵液，置36-37℃恒溫室

8、培養(yǎng)。5.3取無菌樣注意事項：5.3.1取無菌樣時要提前半小時開蒸汽消毒取樣管路