GBT27536-2011豬流感病毒分離與鑒定方法.pdf

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1、ICS11．220B41圓雪中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB／T27536--2011豬流感病毒分離與鑒定方法Isolationandidentificationofswineinfluenzavirus2011-11-21發(fā)布2012—03—01實(shí)施宰瞀髏鬻瓣警矬瞥霎發(fā)布中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會促19標(biāo)準(zhǔn)分享網(wǎng)www.bzfxw.com免費(fèi)下載刖置本標(biāo)準(zhǔn)按照GB／T1．1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國農(nóng)業(yè)部提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國動物防疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(sAc／Tc181)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草

2、人：喬傳玲、楊煥良、陳艷、辛?xí)怨?、陳化蘭。GB／T27536--201標(biāo)準(zhǔn)分享網(wǎng)www.bzfxw.com免費(fèi)下載1范圍豬流感病毒分離與鑒定方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬流感病毒分離與鑒定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于各種亞型豬流感的病原分離和鑒定。2試驗(yàn)材料、試劑2．1剪刀、鑷子。2．21mL注射器。2．3單道及多道微量移液器、吸頭。2．49～11日齡SPF雞胚。2．5犬腎細(xì)胞(MDCK)。2．66孔培養(yǎng)板。2．7DMEM培養(yǎng)基。2．8HEPES緩沖液(1moI／L儲存液)。2．9胎牛血清。2．10TPCK-胰蛋白酶(胰蛋白酶經(jīng)TPCK處理)。2．110．01mol／Lp

3、H7．o～7．4磷酸鹽緩沖液(PBS)(參見附錄A中A．1)。2．12磷酸鹽緩沖液(pH5．9)(參見附錄A中A．5)。2．130．85％生理鹽水(參見附錄A中A．2)。2．14阿氏(Alsevers)液(參見附錄A中A．3)。2．150．5％紅細(xì)胞懸液(參見附錄A中A．4)。2．16胎球蛋白(參見附錄A中A．6)。2．17過碘酸鹽(參見附錄A中A．7)。2．18亞砷酸鹽(參見附錄A中A．8)。2．19硫代巴比妥酸(參見附錄A中A．9)。2．20無菌蒸餾水或去離子水。3儀器GB／T27536--20113．1生物安全柜(柜內(nèi)負(fù)壓，有HEPA過濾器可避

4、免細(xì)胞培養(yǎng)物污染及保護(hù)操作人員安全)。3．2孵化器。3．3COz培養(yǎng)箱。3．4臺式高速冷凍離心機(jī)。3．537℃水浴加熱器。3．6煮沸鍋。3．7棉拭子(醫(yī)用棉簽)。3．8研磨器。標(biāo)準(zhǔn)分享網(wǎng)www.bzfxw.com免費(fèi)下載GB／T27536--20114樣品采集與處理4．1樣品的采集病死豬，取肺臟或氣管分泌物；待檢活豬，用棉拭子(醫(yī)用棉簽)采集鼻腔深部分泌物。4．2樣品的保存樣品應(yīng)置于特定的樣品保存液中進(jìn)行保存。一般采用磷酸鹽緩沖液(pH7．o～7．4，0．01tool／L)、0．85％生理鹽水或者不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液作為保存液(含青霉素2000IU／

5、mL、鏈霉素2000IU／mL、制霉菌素1000Iu／mL，牛血清白蛋白5mg／mL)。樣品采集后應(yīng)置于加冰的保溫箱中、密封，24h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理或置--70℃保存。4．3樣品的處理用剪刀采組織病料置于研磨器中，按質(zhì)量體積比(1：1)加入樣品保存液進(jìn)行研磨；將棉拭子置于裝有1mL樣品保存液的離心管中，用鑷子充分?jǐn)D壓后棄去拭子。以上樣品室溫靜置作用30rain，4℃3000r／rain離心5rain，取上清作為接種材料。5樣品接種5．1雞胚培養(yǎng)1mL注射器吸取處理好的樣品，以0．2raL／胚的量經(jīng)尿囊腔和羊膜腔途徑接種9～11日齡SPF雞胚，每個

6、樣品接種3個胚，于35℃～37℃孵化箱內(nèi)孵育72h～96h，棄去24h內(nèi)死亡雞胚。孵化至96h將雞胚制冷后，無菌收取24h以后死亡雞胚及96h仍存活雞胚的尿囊液和羊水。5．2細(xì)胞培養(yǎng)在生物安全柜中操作，將60％～80％長滿單層的MDCK細(xì)胞的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板用細(xì)胞培養(yǎng)液(不含胎牛血清，含有TPCK處理的胰酶2btg／mL的DMEM培養(yǎng)基)洗三次，加入適量的處理樣品，置于5％COz、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h～2h，期間每隔30rain輕輕搖動一次。感作完畢，棄去感作物，用含有胰酶的培養(yǎng)液洗三次，加入適量的細(xì)胞維持液，5％CO：，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)5d～

7、7d，期間觀察細(xì)胞病變(CPE)的形成情況。如出現(xiàn)CPE(特征病變?yōu)椋杭?xì)胞腫脹圓化，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞核固縮或破裂，嚴(yán)重時(shí)細(xì)胞部分或全部脫落)，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。5．3結(jié)果判定收獲雞胚液或細(xì)胞培養(yǎng)上清，測定其血凝活性(具體操作見6．1)。若HA反應(yīng)陽性說明可能有粘病毒科的病毒，應(yīng)采用HA-HI試驗(yàn)進(jìn)行血凝素亞型的鑒定；若無血凝活性或血凝價(jià)很低，應(yīng)盲傳3～5代，若仍陰性，則認(rèn)為病毒分離陰性。6亞型鑒定6．1IIA試驗(yàn)6．1．1在微量反應(yīng)板的1～12孔均加入0．05mLPBS，換吸頭。6．1．2吸取0．05mL待鑒定病毒液，加入第1孔，反復(fù)抽打3～5次混

8、勻。2標(biāo)準(zhǔn)分享網(wǎng)www.bzfxw.com免費(fèi)下載GB／T27536--20116．1．3從第l孔吸取0．0