二硫鍵檢測方法

《二硫鍵檢測方法》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。

２。3.1．4MBP—Pｅrmatin蛋白中半胱氨酸殘基及二硫鍵數(shù)目的測定L半胱氨酸可于5,5-二巰基雙—2硝基甲苯（DＴNＢ)發(fā)生硫醇-二硫化物交換反應(yīng),在堿性條件下反應(yīng)顯黃色,在４12ｎｍ處有強(qiáng)烈吸收峰.該反應(yīng)可特異地檢測-SH,從而定量檢測L半胱氨酸含量。分析ＭBP標(biāo)簽氨基酸序列可知,該標(biāo)簽蛋白中不含有半胱氨酸，故不影響原核表達(dá)的Peｒmatiｎ中半胱氨酸殘基的數(shù)目.采用ＤＴNB方法測定樣品的巰基數(shù),其方法的主要步驟為:　　１)樣品先用8　M尿素37℃處理4h;?　2)游離巰基數(shù)的測定:　向未經(jīng)尿素處理的１.0ｍｌ樣品(0.3８mｇ/ｍｌ）中加入2ｍlTrｉs—Ｇｌy(0。08６MTris,0.09MGly,pH8。0）,加入50μl　DTNＢ(１０mMDTNB，20０　mMTris—HＣｌ,pH?。?0),5min后測定412nm處的吸光值;3)　總的巰基數(shù)的測定:向經(jīng)尿素處理的0．５mｌ樣品中加入2ｍlＴｒis—Gｌy,加入5０μlβ-巰基乙醇（β-MＥ），37℃溫浴1h,加入10　ml１2％三氯乙酸（TＣＡ）,37℃溫?。県,１1０00rｐm離心3０ｍiｎ,用５mｌ1２%ＴＣA重懸沉淀兩次，以徹底去除β-ME,最后用2mlTris—Gly重溶沉淀,加入50μｌDTNB溶液,5　mｉｎ后測定４12ｎｍ處的吸光值。 利用公式:μmoｌSＨ/g=73。53×A４１２×Ｄ/C進(jìn)行計(jì)算.其中Ａ412是412nm處的吸光值,　D為稀釋倍數(shù),Ｃ為蛋白濃度,　７3.５3是一個(gè)系數(shù),由１06/１。36x1０４得到。