細(xì)胞核熒光染料

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細(xì)胞核常用熒光染料有：吖啶橙（AcridineOrange，AO）、溴化乙錠（EthidiumBromide，EB）和碘化丙啶（PropidiumIodide，PI），DAPI、Hoechst染料、EthDIII、7-AAD、RedDot1、2等等。透膜的染料如下：AO：具有膜通透性，能透過細(xì)胞膜，將核DNA和RNA分別染成綠色和紅色，因此使細(xì)胞核呈綠色或黃綠色熒光。EB：一種高度靈敏的熒光染色劑，在標(biāo)準(zhǔn)302nm處激發(fā)出橙紅色信號。DAPI：藍(lán)色一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料，其與DNA結(jié)合后可以產(chǎn)生比DAPI自身強(qiáng)20多倍的熒光，而與單鏈DNA結(jié)合無熒光的增強(qiáng)。DAPI對雙鏈DNA的染色靈敏度要高于EB和PI，熒光強(qiáng)度比Hoechst低，但光穩(wěn)定性高于Hoechst。Hoechst染料：藍(lán)色一類在顯微觀察中標(biāo)記DNA的熒光染料，最常見的兩種是Hoechst33342和Hoechst33258。這兩種染料都在紫外350nm處被激發(fā)，在461nm處最大發(fā)射光附近發(fā)射青/藍(lán)色熒光。與DAPI相比，Hoechst33342加有乙基，具有更強(qiáng)的親脂性，因此能更好的透過完整的細(xì)胞膜，并且細(xì)胞毒性更小。RedDot1染料：?紅色，超強(qiáng)的細(xì)胞核選擇性，其光譜相似于Draq?5和Draq?7。RedDot?染料可被幾種常見的激光激發(fā)并可在遠(yuǎn)紅外區(qū)激發(fā)熒光。RedDot?的紅色近紅外熒光有效的與其他常用熒光探針區(qū)分開來。不透膜的染料，如下：PI：不同通過活細(xì)胞膜，但卻能穿過破損的細(xì)胞膜而對核染色。PI作為紅色熒光復(fù)染劑首選，PI經(jīng)常與Calcein-AM或者FDA等熒光探針合用，區(qū)分死/活細(xì)胞。EthDIII、7-AAD、RedDot2：不能透過細(xì)胞膜，但能將壞死細(xì)胞區(qū)分開來；更適合凋亡壞死實(shí)驗(yàn)的檢測；細(xì)胞核熒光染料（PIDAPIHoechst33342）細(xì)胞核熒光染料PI碘化丙啶（簡稱PI）是一種常用的細(xì)胞核熒光染色劑。它不能透過完整的細(xì)胞膜，但PI能透過凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞的膜而將細(xì)胞核染紅，PI在綠色光（540nm波長）的激發(fā)下，會在600nm（紅色光）處發(fā)出明亮的熒光，與細(xì)胞核中的DNA結(jié)合的PI發(fā)出的熒光，與未結(jié)合的PI相比，強(qiáng)度會增強(qiáng)20-30倍。40016Propidiumiodide(PI)100mg40017Propidiumiodide,1.0mg/1mLsolutioninwater10mL碘化丙啶英文名：　Propidiumiodide,Propidiumdiiodide;PI分子式：C27H34I2N4分子量：668.39外觀：紅棕SF末應(yīng)用：DNA染色染色原理：碘化丙啶(PI)是一種溴化乙啶的類似物，它在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光。盡管PI不能通過活細(xì)胞膜，但卻能穿過破損的細(xì)胞膜而對核染色。PI經(jīng)常被用來與Calcein-AM或者FDA等熒光化合物一起使用，能同時(shí)對活細(xì)胞和死細(xì)胞染色。光譜性質(zhì)：PI-DNA復(fù)合物的激發(fā)和發(fā)射波長分別為535nm和615nm。染色過程：1．用PBS或適當(dāng)?shù)木彌_液制備10～50μM的PI溶液。a)2．將1/10培養(yǎng)基體積的PI溶液加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中。b)3．在37℃培養(yǎng)細(xì)胞10-20分鐘。4．用PBS或合適的緩沖液洗滌細(xì)胞兩次。5．用535nm激發(fā)波長，615nm發(fā)射波長的濾光器的熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。a)由于PI可能具有致癌性，請小心操作。b)也可以用1/10濃度的PI緩沖液代替培養(yǎng)基。保存條件：4℃避光保存對人體有刺激性，請注意適當(dāng)防護(hù)

1DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)﹐是一種能夠與DNA中大部分A，T堿基相互結(jié)合的熒光染料﹐常用與熒光顯微鏡觀測。因?yàn)镈API可以透過完整的細(xì)胞膜﹐它可以用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞的染色。在熒光顯微鏡觀察下，DAPI染劑是利用紫外光波長的光線激發(fā)。當(dāng)DAPI與雙股DNA結(jié)合時(shí)，最大吸收波長為358nm，最大發(fā)射波長為461nm，其發(fā)散光的波長范圍含蓋了藍(lán)色至青綠色。DAPI也可以和RNA結(jié)合，但產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度不及與DNA結(jié)合的結(jié)果，其發(fā)散光的波長范圍約在400nm左右。DAPI的發(fā)散光為藍(lán)色，且DAPI和綠色熒光蛋白(Greenfluorescentprotein,GFP)或TexasRed染劑(紅色熒光染劑)的發(fā)散波長，僅有少部分重疊，研究員可以善用這項(xiàng)特性在單一的樣品上進(jìn)行多重?zé)晒馊旧?。DAPI能快速進(jìn)入活細(xì)胞中與DNA結(jié)合，因此DAPI對生物體而言，也被視為一種毒性物質(zhì)與致癌物。使用過程中應(yīng)注意操作與拋棄的處理程序。DAPI為一種熒光染料，可以穿透細(xì)胞膜與細(xì)胞核中的雙鏈DNA結(jié)合而發(fā)揮標(biāo)記的作用，可以產(chǎn)生比DAPI自身強(qiáng)20多倍的熒光，和EB相比，對雙鏈DNA的染色靈敏度要高很多倍。顯微鏡下可以看到顯藍(lán)色熒光的細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞標(biāo)記的效率高(幾乎為100%)，且對活細(xì)胞無毒副作用。DAPI染色常用于細(xì)胞凋亡檢測，染色后用熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞儀檢測。DAPI也常用于普通的細(xì)胞核染色以及某些特定情況下的雙鏈DNA染色。細(xì)胞經(jīng)熱激處理后用DAPI染色3分鐘，在熒光顯微鏡下可以看到到細(xì)胞核的形態(tài)變化。Hoechest33258是膜透性的,因此在活細(xì)胞時(shí)候能輕松進(jìn)入;DAPI是半透性的,有選擇性的進(jìn)入.因此Hoechest33258一般用來染活細(xì)胞,可以長驅(qū)直入;DAPI一般是染固定細(xì)胞.2、兩者都可以用紫外看，參見以下的激發(fā)發(fā)射波長Hoechst33258的最大激發(fā)波長為346nm，最大發(fā)射波長為460nm；Hoechst33258和雙鏈DNA結(jié)合后，最大激發(fā)波長為352nm，最大發(fā)射波長為461nm。DAPI的最大激發(fā)波長為340nm，最大發(fā)射波長為488nm；DAPI和雙鏈DNA結(jié)合后，最大激發(fā)波長為364nm，最大發(fā)射波長為454nm。Hoechst33342/PI雙染色法1．懸浮生長的細(xì)胞在培養(yǎng)狀態(tài)下加入Heochst33342，終濃度為1μg/ml；帖壁生長的細(xì)胞用含有0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，離心，棄上清，用1ml全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，加入Heochst33342，終濃度為1μg/ml，37℃孵育7～10min。2．4℃500～1000r/min離心棄去染液。3．加入1.0mlPI染液，4℃避光染色15min。

2??碘化丙啶染色????1．原理?碘化丙啶(propidiumiodide，PI)不能穿人完整的活細(xì)胞膜中，即正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞在不固定的情況下對PI拒染，而壞死細(xì)胞由于失去膜的完整性，PI可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA結(jié)合，根據(jù)此特點(diǎn)，使用PI染色可鑒別死細(xì)胞。如果對活細(xì)胞染色必須在染色前進(jìn)行固定，以增加細(xì)胞膜對染料的通透性。????2．溶液配制?使用0．01mol／LPBS(pH7．4)配制終濃度為0．5mg／ml的PI工作液。????3．染色程序???(1)單層細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)本經(jīng)預(yù)冷70％乙醇固定1小時(shí)，4℃；???(2)0．01mol／LPBS(pH7．4)沖洗；???(3)瀝干后加入PI工作液，室溫孵育15分鐘；???(4)沖洗后封片。????結(jié)果：PI最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長分別為488nm和630nm，熒光顯微鏡觀察，DNA呈紅色熒光。