煙酰胺高產(chǎn)菌種篩選及煙酰胺檢測生產(chǎn)工藝優(yōu)化正稿模板

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煙酰胺高產(chǎn)菌種篩選及煙酰胺檢測生產(chǎn)工藝優(yōu)化正稿模板752020年4月19日

1資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。高酶活煙酰胺生產(chǎn)菌株的篩選及腈水合酶催化反應條件優(yōu)化摘要煙酰胺作為B族維生素的重要成員,參與了機體內(nèi)兩種重要輔酶的形成。煙酰胺作為重要的營養(yǎng)性添加劑被廣泛應用于應用于飼料生產(chǎn)行業(yè),其在醫(yī)藥、食品、化妝品行業(yè)的應用前景也非常廣闊。在工業(yè)生產(chǎn)方面,人們主要利用化學法和微生物法進行煙酰胺生產(chǎn)。煙酰胺的微生物生產(chǎn)法有著化學法無法比擬的優(yōu)越性,此方法對環(huán)境幾乎不造成污染,且生產(chǎn)成本低,工藝簡便。在本實驗中,主要以下四個方面進行了實驗研究并取得了一定的成果:(1)以實驗室現(xiàn)有菌種HD1220為出發(fā)菌株,分別使用ARTP誘變、微波誘變、EMS誘變?nèi)N單因子誘變以及在各因子最佳誘變條件下的復合誘變,確定了復合誘變的最佳條件為:ARTP誘變時間240s;微波誘變強度60%,微波照射時間90s,;EMS濃度0.8%。誘變完成后,篩選出一株能夠穩(wěn)定遺傳且酶活高達1764U的高腈水合酶活性菌株,與出發(fā)菌株相比,誘變后菌株酶活提高了33.13%,并將該菌株暫時命名為NHD-1。(2)利用HPLC對煙酰胺進行檢測,752020年4月19日

2資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。經(jīng)過對HPLC檢測的紫外檢測波長、流動相流量、流動相比例三個條件進行的單因素優(yōu)化實驗,最終確定HPLC檢測煙酰胺的各個最優(yōu)條件為:紫外檢測波長為220nm,流動相的流量為0.4mL/min,流動相中甲醇:水=1:3。在以上條件下,煙酰胺出峰時間為5.306min,與條件優(yōu)化前相比,煙酰胺出峰時間明顯縮短。(3)對腈水合酶參與煙酰胺生產(chǎn)過程中酶催化反應條件進行單因素優(yōu)化實驗,我們得出各因素的最佳條件為:菌體濃度1.8%,菌齡48h,底物濃度100g/L,溫度29.5℃,PH7.4,反應時間30min,在實際發(fā)酵后期應該對產(chǎn)物煙酰胺進行及時分離。經(jīng)過Plackett-Burman實驗設計我們分析出底物濃度、溫度和PH這三個因素對腈水合酶的酶活有及其顯著的影響;經(jīng)過對這三個因素進行響應面優(yōu)化設計,我們得出了這三個因素的最佳條件組合為底物濃度98.88g/L,反應溫度29.59℃,PH值7.46。在此條件下酶活響應值為1784U。對SAS軟件統(tǒng)計分析結(jié)果進行三次驗證實驗,得到腈水合酶的實際酶活為1775U,與多元回歸分析所得理論值吻合,說明利用響應面法能夠很好的優(yōu)化酶催化反應條件。ABSTRACT752020年4月19日

3資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。NicotinamideisakindofVitaminBandit’sveryimportant.Inthebody,It’sonepartoftheformationoftwokindsofcoenzyme.Nicotinamideismainlyusedinfeedindustryasnutritionadditives,italsohasaverybroadapplicationprospectinmedicalindustry,foodindustryandcosmeticsindustry.Intheindustrialproductionofnicotinamide,wemainlyusechemicalmethodandbiologicalmethod.Thebiologicalmethodhasabigsuperioritythatchemicalmethodhasn’titdoeslittleharmtotheenvironmentandhasalowerproductioncost,andit’sverysimpleinprocess.Undertheconditionsoflaboratory,wemainlycarriedoutourresearchinseveralaspectsandachievedsomeresultsasfollows:(1)StartedfromthestrainNorcardiasp.HD9611wehadinthelaboratory,weusedthemethodofARTPmutagenesis,microwavemutagenesisandEMSmutagenesistomakemutagenesisofthestrain.Thethreemethodswereallusedalone.Thenwemadethecompositemutagenesisunderbestconditionsofthethreemethodofmutagenesis.Thebestconditionsofcompositemutagenesiswere:thetimeofARTPmutagenesiswas240s;thetimeandintensityofmicrowavewere90sand60%;theconcentrationofEMSmutagenesiswas0.8%.Bythemutagenesiswescreenedonestainwhosenitrilehydratasehadaveryhighenzymeactivityof1764Uandthestainhadstableheredity.ComparedtothestainNorcardiasp.HD9611,theenzymeactivity752020年4月19日

4資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。increasedby33.13%,andwenamedthestainasNHD-1.(2)InthedetectionofNicotinamide,weusedtheHPLCmethod.ByoptimizingthewavelengthofUVdetection,theflowrateofmobilephaseandtheproportionofmobilephaseintheHPLCassay,wegotthebestconditionsofHPLCmethod:thewavelengthofUVdetectionwas220nm;theflowrateofmobilephasewasmethanol:water=1:3;theproportionofmobilephasewas0.4mL/min.undertheseconditions,thepeaktimeofniacinamidewas5.306min.Comparedtothemethodbeforeoptimizationweused,thepeaktimesignificantlyshortened.(3)Byoptimizingtheconditionsofcatalyticreactionofthenitrilehydratase,wegotthebestconditions:theconcentrationofbacteriaproducingniacinamidewas1.8%;thefungusagewas48h;theconcentrationofsubstratewas100g/L;thetemperaturewas29.5℃;thePHwas7.4;thereactiontimeis30min,andweshouldseparatenicotinamidelateintheactualfermentation.ByPlackett-Burmanexperimentweconfirmedthatconditionsofconcentrationofsubstrate,temperature,PHhadsignificantinfluencesontheenzymeactivityofnitrilehydratase.Byresponsesurfacetestweoptimizedthesethreefactors:theconcentrationofsubstratewas98.88g/L;thetemperaturewas29.59℃;thePHwas7.46.Undertheseconditions,weanalyzedtheenzymeactivityis1784U.Throughverificationtest,weconfirmed752020年4月19日

5資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。theenzymeactivityofnitrilehydratasewas1775U.Itwasveryclosetothetheoreticalvalue.Itshowedthattheresponsesurfacetestwasaveryeffectivemethodinoptimizationofenzymecatalysis.Keyword:mutagenesnitrilehydrataseenzymeactivityHPLCoptimization1前言1.1煙酰胺的概述1.1.1煙酰胺簡介煙酰胺(Nicotinamide)化學名稱為3－吡啶甲酰胺,又維生素B3英文簡稱VB3、NSA[1]。煙酰胺最早從動物肝臟中提取,市場上銷售產(chǎn)品多為化學合成品[2]。煙酰胺的分子式如圖1-1:圖1-1NSA分子式Fig.1-1ThestructureofNSA1.1.2煙酰胺化學性質(zhì)煙酰胺為白色針狀結(jié)晶或結(jié)晶性粉末。熔點為128℃～131℃,沸點為150℃～160℃。煙酰胺極易溶于水,在一般極性有機溶劑溶解752020年4月19日

6資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。,在苯和乙醚中無溶解性[3]。煙酰胺在空氣中對光、熱等條件穩(wěn)定,干燥狀態(tài)50℃以下極其穩(wěn)定。1.1.3煙酸簡介煙酸又稱尼克酸,分子式為C6H5NO2,其整體性質(zhì)與煙酰胺極其相似,但由于羧基的存在導致在某些方面不用與含有酰胺基的煙酰胺。兩者通稱維生素PP(二者混合物),在實際應用中,兩者可相互等量替代[4]。在加熱條件下有無機酸和堿存在條件下,煙酰胺發(fā)生水解反應轉(zhuǎn)化為煙酸。煙酸分子式如圖2圖1-2煙酸分子式Fig.1-1Thestructureofniacin1.1.4煙酰胺用途煙酰胺參與生物體內(nèi)糖原分解、脂類代謝及各種物質(zhì)的氧化作用[5]。煙酰胺有促進細胞新陳代謝等等作用[6]。當煙酰胺缺乏時會出現(xiàn)細胞正常代謝不能正常進行,糖原分解受阻等狀況而引發(fā)糙皮病。在市場上煙酰胺共分為三種:醫(yī)藥級、食品級和飼料。煙酰胺最主要作為營養(yǎng)添加劑在飼料廣泛應用,在食品和醫(yī)藥行業(yè)主要以維生素形式為人們所使用,752020年4月19日

7資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。煙酰胺在電鍍及生化方面也有一定的應用[7]。醫(yī)學上常見來治療糙皮病、口炎、舌炎、肝臟疾病及日光性皮炎的藥物中均含有煙酰胺,其也被用來降低人體膽固醇和甘油三酯含量[8]。煙酰胺應用最廣泛的應用是在飼料工業(yè),其作為重要的飼料添加劑而被大量應用[9]。1.1.5國外和國內(nèi)煙酰胺生產(chǎn)及消費狀況在20世紀50年代,國外煙酰胺的生產(chǎn)已經(jīng)實現(xiàn)工業(yè)大批量生產(chǎn)。當前全世界煙酰胺的總產(chǎn)能約為30kt/a,總產(chǎn)量也突破了20kt/a[10]。世界上瑞士、美國、比利時、印度、西班牙等國家為煙酰胺主要產(chǎn)出國等,瑞士龍沙公司(LONZA)、美國Nepera公司、比利時ReillyTorAG公司等是煙酰胺生產(chǎn)方面巨頭,這些企業(yè)年產(chǎn)能均在千噸以上,瑞士Lonza公司以35%的生產(chǎn)能力位于煙酰胺生產(chǎn)行業(yè)的首位。煙酰胺消費有40%~50%作為飼料添加劑應用在飼料生產(chǎn)方面;25%~30%應用于食品生產(chǎn)加工;20%~25%應用于醫(yī)藥生產(chǎn)方面。美國年均消費煙酰胺量在約10000t以上,占世界消費總量的一半,消費中的80%作為飼料添加劑使用。西歐的煙酰胺消費量也很大。煙酰胺主要出口于日本。隨著第三世界國家飼料等工業(yè)的高速發(fā)展,煙酰胺消費量正以每年超過5%的速度快速增長[12]。752020年4月19日

8資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。中國在20世紀50年代初開始進行煙酰胺的生產(chǎn),首家進行煙酰胺生產(chǎn)的企業(yè)位于上海。中國在70年代的煙酰胺的年產(chǎn)量僅在100左右,由于此時中國煙酰胺的生產(chǎn)還處于剛起步階段,在設備、規(guī)模等方面還存在著很大的不足。90年代初,隨著國外先進生產(chǎn)技術的引進,中國出現(xiàn)了多家從事大規(guī)模生產(chǎn)煙酰胺的企業(yè),比較著名的有南通醋酸化工股份有限公司、廣州龍沙精細化工有限公司、浙江富陽勝大生化科技有限公司、山東濰坊一邦化工科技有限公司等[13]。其中廣州龍沙有限公司是最早引進國外先進生產(chǎn)技術進行煙酰胺大規(guī)模生產(chǎn)的企業(yè),它是由中國廣藥和瑞士龍沙雙方合資建設而成,年產(chǎn)煙酰胺達3400t。到20世紀初期,中國煙酰胺年生產(chǎn)能力超過8000t的企業(yè)已有6家,而且實現(xiàn)了對東南亞地區(qū)的規(guī)模性輸出[14]。和國外煙酰胺應用一樣,中國所消費的煙酰胺主要用于飼料工業(yè),比重占到總消費量的約80%。1.2煙酰胺生產(chǎn)工藝1.2.1煙酰胺的化學合成法利用化學合成法進行煙酰胺的生產(chǎn)依舊是當前工業(yè)上的主流工藝?；瘜W合成工藝的原材料主要是吡啶類物質(zhì),752020年4月19日

9資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。主要利用各種化學物質(zhì)與吡啶類物質(zhì)的氧化反應來生產(chǎn)煙酰胺。應用氧化方法首先得到煙腈,之后將煙腈在合適條件下進行堿水解得到煙酰胺[15~17]。在氧化生產(chǎn)過程中,吡啶類物質(zhì)與煙酰胺的原料產(chǎn)出比約為0.95:1,因此工業(yè)上煙酰胺產(chǎn)量的決定性因素依舊是原材料物質(zhì)的產(chǎn)量。1.2.2煙酰胺的微生物發(fā)酵法與化學工藝相比,煙酰胺的微生物生產(chǎn)法有著獨特的優(yōu)勢:(1)反應條件溫和,一般在常溫常壓下既能完成,沒有爆炸、污染嚴重等問題。(2)原材料物質(zhì)易得且廉價。微生物發(fā)酵所用的原料一般為淀粉、糖蜜或者其它農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品,不需要精制處理即可直接用于發(fā)酵生產(chǎn)。(3)微生物的自主調(diào)控。微生物參與的反應一般都有自身的酶系或者代謝機制調(diào)解完成,無需過多的認為參與。(4)高度的專一性和選擇性。由于微生物體內(nèi)的酶具有專一性,因此微生物本身能夠?qū)Ｒ恍缘膶δ承碗s化合物進行特定部位等的氧化、還原、官能團導入等等反應從而實現(xiàn)生產(chǎn)。(5)環(huán)境污染小。微生物發(fā)酵工業(yè)的”三廢”對環(huán)境污染小,對生物體也基本無害。這是微生物發(fā)酵相比于一般發(fā)酵最為顯著地優(yōu)越性。(6)此方法投資較小,見效較快,而且在效益方面潛力巨大。因此,針對煙酰胺生產(chǎn)來說,實現(xiàn)微生物發(fā)酵生產(chǎn)煙酰胺具有非常重大的意義,752020年4月19日

10資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。這也將改變煙酰胺生產(chǎn)工業(yè)長久以來的一些難以改變的不利因素[18]。法國研究員Galzy及其研究組最早提出了煙酰胺的微生物發(fā)酵方法[19],而且在實驗過程中確定了煙酰胺發(fā)酵的菌株。此后經(jīng)過對微生物轉(zhuǎn)化腈類物質(zhì)必須的腈水合酶進行進一步研究,經(jīng)過研究得出腈水合酶參與反應所需最佳條件,該公司實現(xiàn)了腈水合酶活力的不斷提高,并讓丙烯酰胺產(chǎn)量實現(xiàn)三次大幅度提高,到21世紀初期,丙烯酰胺產(chǎn)量已經(jīng)提高到0t/a。中國利用腈類物質(zhì)進行工業(yè)生產(chǎn)起始于90年代中期,利用微生物轉(zhuǎn)化腈類物質(zhì)進行丙烯酰胺生產(chǎn)的知名企業(yè)有江蘇如皋化肥廠,江西南昌農(nóng)科化工有限公司[20]。1.3腈水合酶簡介1.3.1腈水合酶在微生物界的分布腈類化合物一般是由與工業(yè)生產(chǎn)中某些物質(zhì)間的反應所產(chǎn)生的副產(chǎn)物,這些物質(zhì)一般具有很高的毒性,存在于工業(yè)廢水,腈類物質(zhì)很難被分解掉,而微生物體內(nèi)腈水合酶是腈類物質(zhì)最好的催化劑。腈類物質(zhì)對人體來說毒性較強,可是這種物質(zhì)卻能夠作為碳源或者氮源為微生物所利用。自然界中存在的能夠利用腈類物質(zhì)的微生物種類很多,752020年4月19日

11資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。但一般利用率非常低,后來科學家們將這些微生物進行人工馴化培養(yǎng),經(jīng)過改變微生物生長條件及代謝機制,實現(xiàn)了微生物腈水合酶活性的提高。腈水合酶主要存在于短桿菌屬、小球菌屬及諾卡氏菌屬等等。這些菌屬中常見的微生物菌株有:Nocardiasp.9611,BrevibacteriumimperialisCBS489-74,RhodocaccusrhodochrousJI,CorynebacteriumpseudodiphteriumZBB-41,BreviteriumR312,Rhodocaccussp.N-774,Rhodocaccussp.YH3-3,AlcaligenesfaecalisARCC8750,AlcaligenesfaecalisJM,PseudonocardathermophilaJCM3095,Becillussp.BR449,Brecteriumsp.CH2等[21~25]。廣泛分布的含腈水合酶微生物有著它們的相似之處:腈水合酶必須經(jīng)過澳合作用與特定的金屬離子結(jié)合后才能表現(xiàn)出酶活性,在無金屬離子螯合情況下酶活基本為零或者極低。當前已發(fā)現(xiàn)的能與腈水合酶發(fā)生螯合作用的螯合因子主要有鐵離子和鈷離子。含有鈷型腈水合酶的微生物菌株常見的有RhodococcusrhodochrousJI,PseudonocardathermophilaJCM3095等;含有鐵型腈水合酶的微生物菌株常見的有CorynebacteriumpseudodiphteriumZBB-41等[26]。1.3.2腈水合酶的生物調(diào)控752020年4月19日

12資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。能與鈷離子螯合的腈水合酶是由α和β兩個亞基組成的組成的一種水溶性蛋白物質(zhì),由于酶蛋白產(chǎn)生過程中誘導因子的不同,兩個亞基具有了不同的結(jié)構(gòu),從而導致了不同種類微生物內(nèi)腈水合酶分子量的差異,例如菌株Rhodococcussp.N-774體內(nèi)腈水合酶分子量為70KDa,而菌株RhodococcusrhodochrousJI體內(nèi)的腈水合酶則有520KDa和130KDa兩種大小[27]。研究中發(fā)現(xiàn)高酰胺類物質(zhì)生產(chǎn)能力隨著腈水合酶分子量的不同而出現(xiàn)不同,一般認為高分子量腈水合酶更適合酰胺生產(chǎn),這主要是由它的高穩(wěn)定性和高活性決定的。腈水合酶為誘導酶,在特定誘導劑存在下才能產(chǎn)生腈水合酶,以鈷型腈水合酶為例,菌體培養(yǎng)期間腈水合酶的酶活性和其含量只有在有鈷離子存在情況下才會有提高。X射線衍射實驗表明,輔助因子鈷離子與2個N原子(酰胺基團)和3個S原子(半胱氨酸硫醇鹽)形成5個配位鍵。在透析實驗中游離鈷離子全部消失,說明酶活性部位已將它們?nèi)拷Y(jié)合并在螯合作用下轉(zhuǎn)化為自身重要的一環(huán),由此可見鈷離子對腈水合酶的重要性。從決定腈水合酶的基因開始,當基因的擴增,轉(zhuǎn)錄和翻譯過程全部完成后,752020年4月19日

13資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。得到的腈水合酶必須結(jié)合鈷離子才能實現(xiàn)其催化活性,這是我們進行理論研究的重要基礎。1.3.3腈水合酶的反應機理鈷型腈水合酶的酶催化反應的整個催化機制已經(jīng)得到了透徹的研究.當鈷離子進入腈類溶液后,水分子、原料中的腈分子和鈷離子三者相互結(jié)合,氰基中的C-N三鍵在此基礎上實現(xiàn)激活并發(fā)生水合反應,使得-OH基攻擊氰基并與其中C-離子形成一個亞酰胺R-C(-OH)=NH,異構(gòu)化后的亞酰胺即為酰胺類物質(zhì)[28]。1.4課題研究意義煙酰胺作為B族維生素的重要成員,也是機體輔酶的重要組成部分。醫(yī)藥、食品、化妝品以及飼料等等領域都有非常廣泛的應用。隨著社會的發(fā)展,當前煙酰胺在化妝品生產(chǎn)行業(yè)也得到了應用,而其它各行業(yè)對煙酰胺的需求量也在繼續(xù)增加。因此,在工業(yè)中如何有效提高煙酰胺的產(chǎn)量成為人們重視的一個問題。利用微生物法生產(chǎn)煙酰胺是煙酰胺生產(chǎn)的一個重要工藝,它具有化工合成生產(chǎn)不具備的巨大優(yōu)勢。在此工藝中,微生物菌種的活性決定了煙酰胺的產(chǎn)量。因此,高腈水合酶活力生產(chǎn)菌株的篩選對煙酰胺生產(chǎn)具有重要意義。在生產(chǎn)過程中,人們應該適時的對煙酰胺產(chǎn)量及品質(zhì)進行檢測,752020年4月19日

14資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。因此確立一種快速有效的檢測手段對煙酰胺生產(chǎn)也具有重要意義。1.5課題研究內(nèi)容本課題主要從實驗室已有菌種出發(fā),利用現(xiàn)有設備、儀器、藥品及方法并參閱相關文獻資料,獨立完成了以下幾方面研究工作:1.5.1高腈水合酶活力菌株的篩選利用實驗室已具備的各種條件及儀器設備,參閱相關資料文獻,研究ARTP、微波、甲基磺酸乙酯(EMS)三種誘變劑對實驗中出發(fā)菌株中腈水合酶活力的影響,確定了菌種誘變過程中三種誘變劑各自的最佳誘變條件。在單因素誘變的基礎上進行三種影響因素的復合誘變實驗,經(jīng)過不斷的嘗試與篩選,最終選育出具有高酶活性的煙酰胺產(chǎn)生菌株。1.5.2煙酰胺的HPLC檢測條件優(yōu)化。利用高效液相色譜進行煙酰胺檢測,在現(xiàn)有檢測條件的基礎上,經(jīng)過對高效液相色譜檢測中流動相比例、紫外檢測波長、流動相流量、進樣量等條件進行優(yōu)化,確定出煙酰胺檢測最佳的檢測條件。1.5.3煙酰胺高產(chǎn)菌株酶催化反應條件的優(yōu)化752020年4月19日

15資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。經(jīng)過對菌體濃度、底物濃度、反應溫度、PH和菌齡時間五個因素的優(yōu)化實驗,確定最佳的酶反應條件。2材料與方法2.1材料2.1.1菌種諾卡氏菌HD1220,河南大學生命科學院生物工程實驗室保藏。2.1.2培養(yǎng)基活化培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10,酵母膏5,NaCl1,K2HPO42,瓊脂20,pH7.5,115℃滅菌15min。篩選培養(yǎng)基(g/L):3-氰基吡啶8,葡萄糖15,酵母膏3,NaCl1,MgSO40.2,K2HPO40.5,瓊脂15,pH7.5,115℃滅菌15min。種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖15,酵母膏6,尿素6,KH2PO40.5,K2HPO40.5,MgSO4·7H2O0.2,谷氨酸鈉1,pH7.5,115℃滅菌15min。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20,酵母膏9,KH2PO40.5,K2HPO40.5,MgSO4·7H2O0.5,谷氨酸鈉1,脲7,鈷離子12mg,pH7.5,115℃滅菌15min。2.1.3主要試劑在試驗中應用到的主要試劑的規(guī)格以及生產(chǎn)廠家如下表1-1所示:752020年4月19日

16資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。表2-1主要試劑規(guī)格及生產(chǎn)廠家Tab.2-1Specificationsandmanufacturersofmainreagent試劑名稱型號生產(chǎn)廠家葡萄糖分析純天津德恩化學試劑有限公司酵母膏生化級北京奧博星生物技術公司脲分析純鄭州派尼化學試劑廠磷酸二氫鉀分析純天津科密歐化學試劑有限公司磷酸氫二鉀分析純天津科密歐化學試劑有限公司硫酸鎂分析純天津科密歐化學試劑有限公司谷氨酸鈉分析純天津化學試劑六廠氯化鈷分析純天津德恩化學試劑有限公司甲醇色譜級西隴化工股份有限公司鹽酸分析純開封東大化工試劑廠3-氰基吡啶化學級鄭州派尼化學試劑廠氯化鈉分析純天機科密歐化學試劑有限公司瓊脂食品級福建莆田聯(lián)邦瓊脂有限公司氫氧化鈉分析純鄭州派尼化學試劑廠酒石酸鉀鈉分析純天津德恩化學試劑有限公司苯酚生化級天津德恩化學試劑有限公司2.1.4主要儀器在實驗過程中所用到的主要儀器如表1-2所示:752020年4月19日

17資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。表2-2主要儀器型號及生產(chǎn)廠家Tab.2-2Typesandmanufacturersofmainequipments儀器名稱型號生產(chǎn)廠家高效液相色譜儀Waters-1525美國Waters公司常壓等離子體誘變育種儀北京思情源生物科技有限公司全自動高壓蒸汽滅菌鍋SX-500日本TOMY公司潔凈工作臺SW-CJ-2FD蘇州安泰空氣技術有限公司回轉(zhuǎn)式恒溫搖床ZWY-2102上海智城分析儀器有限公司電子天平FA124上海舜宇恒平科學儀器公司移液器DV-04123大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司微波爐KJ23B-DE廣東美的微波爐制造有限公司水浴鍋HH-6國華電器有限公司紫外分光光度計752N上海儀電分析儀器有限公司臺式高速冷凍離心機5810R德國Eppendorf股份公司循環(huán)水式多用真空泵SHB-III鄭州長城科工貿(mào)有限公司旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52AA上海亞榮生化儀器廠2.2實驗方法2.2.1菌種培養(yǎng)方法菌種活化:將保藏于超低溫冰箱中的菌種取出,在30℃條件下放置10min,之后進行梯度稀釋涂布平板,之后置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h斜面培養(yǎng):挑取平板上面生長情況良好的菌落轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)基進行培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為30℃,培養(yǎng)時間為48h。液體種子培養(yǎng)基:斜面培養(yǎng)菌種取一環(huán)接入液體種子培養(yǎng)基,之后放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱振蕩培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為30℃752020年4月19日

18資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。,搖瓶裝液量為30mL,轉(zhuǎn)速為200r/min,培養(yǎng)時間為36h。液體發(fā)酵培養(yǎng)基:將培養(yǎng)好的種子液以5%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為30℃,搖瓶裝液量為30mL,轉(zhuǎn)速為200r/min,培養(yǎng)時間為48h。2.2.2高酶活煙酰胺生產(chǎn)菌種的誘變及選育(1)等離子體誘變等離子體主要指電離氣體,只有當帶電粒子密度達到其建立的空間電荷足以限制其自身運動時,帶電粒子才會影響整個體系的性質(zhì),此時才會形成等離子體[29]。當氣體經(jīng)過電場作用后,基態(tài)原子在電子動能、粒子碰撞的作用下向高能級躍遷稱為激發(fā)態(tài)。在此過程中,電子、光子、正負離子得以形成。等離子體主要是氣體在加熱或者強電磁場作用下電離產(chǎn)生的,主要由電子、離子、原子、分子、活性自由基及射線等組成。其中的活性自由基及射線,如紫外線、γ射線等對微生物具有很強的滅殺作用。近20年來,隨著人們對等離子體研究的日益深入,它在滅菌和生物誘變方面的應用也引起了人們的關注。比較普遍采用的等離子體消毒裝置有高頻電磁場、激光和微波等離子體,等離子云有空氣、氦氣、氮氣、氧氣、鹵素氣體等,752020年4月19日

19資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。所研究的微生物有大腸桿菌、釀酒酵母、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草桿菌等[31~33]。根據(jù)等離子體的各種性質(zhì),我們對具體實驗過程進行了設計,具體流程如下:(1)常溫等離子體誘變出發(fā)菌株的制備本實驗誘變所用菌株為諾卡氏菌HD1220,保藏于溫度為—70℃的超低溫冰箱中。將出發(fā)菌株從超低溫冰箱中取出在平板上活化,在30℃培養(yǎng)48h,之后轉(zhuǎn)接兩代,從第三代生長良好的平板中挑出菌落最大、長勢最好的菌落作為出發(fā)菌株,轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)48h之后,在200r/min旋轉(zhuǎn)式搖床上震蕩培養(yǎng)36h,將培養(yǎng)好的種子液用0.8%生理鹽水進行稀釋,經(jīng)過血球計數(shù)板鏡檢實驗使菌液濃度控制在108個/mL。(2)等離子體誘變本實驗所使用的誘變設備是北京思情源生物科技有限公司生產(chǎn)的常壓等離子體誘變育種儀。該儀器所使用的氣體為氦氣,在使用前需先設定氣體流量為10mL/min,打開紫外燈殺菌處理20min。取經(jīng)過稀釋處理的菌液10μL置于誘變專用的載片上,涂抹均勻制成菌膜后進行誘變處理。本裝置采用紫外滅菌,以空氣為傳導介質(zhì),在常壓下,752020年4月19日

20資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。滅菌室內(nèi)電極經(jīng)過特定條件激發(fā)產(chǎn)生輝光放電形成等離子體。在射頻功率300W下以60s為梯度,對樣品分別進行60s、120s、180s、240s、300s、360s的誘變處理,誘變后樣品放入1mLEP管內(nèi),加入1mL無菌生理鹽水震蕩洗脫,將洗脫液稀釋成10-1~10-7的濃度梯度,取10-4、10-5、10-6三個稀釋度涂布平板,30℃培養(yǎng)48h后對平板菌落進行觀察統(tǒng)計,以每皿菌落數(shù)在100左右為最佳濃度,從而計算出不同誘變時間所對應的致死率情況。致死率計算公式為:致死率=100%﹣存活率存活率=(誘變后存活菌落數(shù)×相應稀釋倍數(shù))／(對照平板菌落數(shù)×相應稀釋倍數(shù))根據(jù)致死率與誘變時間對應關系,我們能夠制作出致死率曲線。(3)高產(chǎn)菌株初篩在各個誘變時間相對應的平板上分別挑出30株不同形態(tài)的菌落及一株不經(jīng)過誘變處理的平板菌落接斜面在30℃條件下培養(yǎng)48h,之后轉(zhuǎn)接種子瓶培養(yǎng)36h后,以5%接種量轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)48h測定配活力,規(guī)定誘變后酶活高于出發(fā)菌株且酶活為其1.1倍以上的突變株定義為正突變株,酶活低于出發(fā)菌株且酶活為其0.9倍以下的突變株定義為負突變株。然后對突變株的突變率進行統(tǒng)計,根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果,752020年4月19日

21資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。選擇最高正突變率所對應的時間點作為誘變處理時間。正突變率的計算方法為:正突變率=正突變菌株數(shù)／突變株總數(shù)×100%(2)微波誘變利用微波進行菌種誘變是一種新興的誘變手段、微波誘變主要利用微波的輻射作用,微波輻射是一種低能的電磁輻射,在誘變育種領域,它對微生物具有較強的生物效應,這種生物效應主要包括兩個方面:熱效應和非熱效應。熱效應主要是指在一定功率和一定頻率下,經(jīng)過電磁輻射對微生物進行照射,引起局部溫度上升,從而引起微生物體內(nèi)一些生理生化反應的變化,甚至死亡;非熱效應是指在電磁波作用下,特別是在長時間及低溫的電磁場作用下,生物體并沒有明顯的溫度變化,或者生物體自身溫度變化在自然范圍內(nèi),但卻能夠產(chǎn)生強烈的生物效應,并在生物體內(nèi)產(chǎn)生各種生理,生化功能的變化,表現(xiàn)為頻率和功率的選擇性上。由于微波這兩種效應的存在,從而能夠引起生物體內(nèi)產(chǎn)生一系列的正突變效應和負突變效應。在本實驗中,菌種誘變所使用的微波爐為廣東美的公司制造的型號為752020年4月19日

22資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。KJ23B-DE型微波爐,微波輸出功率800W,頻率為2450MHz。微波爐具有低火、中低火、中火、中高火、高火五種不同的檔位,如果設定高火檔位為100%,那么其它四種檔位按照先后順序分別為80%、60%、40%、20%。在實驗中,我們從不同的照射強度和不同的照射時間兩個方面進行菌種的誘變。為了確定微波誘變最佳輸出功率,我們設定在照射時間為60s時,取經(jīng)過稀釋的菌懸液5mL于無菌培養(yǎng)皿中,開蓋放入微波爐,設定微波爐輸出頻率分別為20%、40%、60%、80%、100%進行照射處理,之后在4℃冰箱中放置2h以減少回復突變,然后進行平板培養(yǎng),并進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。對經(jīng)過培養(yǎng)的誘變菌株進行存活率及正負突變率進行統(tǒng)計,最終確定出最佳照射強度。經(jīng)過上述實驗,我們確定了最佳照射強度,在此基礎上,將裝有5mL稀釋菌液的培養(yǎng)皿開蓋置于微波爐中,設定照射時間分別為30s、60s、90s、120s、150s、180s,進行誘變處理。將誘變后菌種在冰箱中冷藏2h后進行固體培養(yǎng)并進行發(fā)酵培養(yǎng),統(tǒng)計菌株存活率及正負突變率,最終確定最佳照射時間。(3)甲基磺酸乙酯誘變甲基磺酸乙酯是一種在微生物育種領域常見的化學誘變劑,752020年4月19日

23資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。簡稱EMS。EMS是一種重要的致癌物,在生物學上,EMS常見作突變體庫的建立、微生物育種等。EMS對微生物具有誘變效應的機理主要是EMS能使基因中的鳥嘌呤烷基化,并使烷基化的鳥嘌呤與胸腺嘧啶配對,代替了胞嘧啶,從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)換型突變效應,另外,由于鳥嘌呤烷基活化導致糖苷鍵斷裂造成在DNA復制過程中堿基對發(fā)生替換。EMS誘發(fā)的這種染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)量方面的變化是其誘變效應的主要表現(xiàn)。本實驗選用EMS作為誘變因子,首先要確定EMS的濃度,由于EMS為液體物質(zhì),我們需要從EMS母液出發(fā)進行稀釋。取0.5mLEMS溶解于9.5mLPH為7.2的磷酸緩沖液,將其配置成體積分數(shù)為5%的EMS母液,震蕩搖勻后待用。分別取不同體積的菌液,將其與EMS母液進行混合,混合后濃度分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%,將混合液裝入無菌三角瓶中,在30℃下置于震蕩培養(yǎng)箱中震蕩培養(yǎng)30h,最后加入一定量的2%硫代硫酸鈉終止反應。將誘變后菌種進行固體培養(yǎng)并進行發(fā)酵培養(yǎng),統(tǒng)計誘變后菌種的存活率和正負突變率,確定最佳EMS濃度。(4)復合誘變在誘變育種過程中,如果對同一菌株進行長期的單一因子誘變,會使該菌種對誘變劑產(chǎn)生”疲勞效應”752020年4月19日

24資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。,從而會是誘變效果大大降低。單一誘變因子的長期使用會改變菌株的某些生理特性,比如可能會使菌株生長緩慢,代謝效率降低,對于真菌會導致孢子產(chǎn)生量減少,這些負面效應不利于發(fā)酵工藝的控制。在實際生產(chǎn)中,復合誘變能有效的減少這些負面效應。復合誘變包括多種誘變劑的先后使用,同一種誘變劑的重復使用和多種誘變劑的同時使用。人們普遍認為,復合誘變具有明顯的協(xié)同效應,多種誘變劑的合理搭配及使用效果要明顯優(yōu)于單一誘變劑的誘變效果。在本實驗中,復合誘變實在單因子誘變基礎上進行的,復合誘變所使用誘變劑分別為等離子體、微波和EMS三種因子。取5mL稀釋過的菌懸液加入到無菌培養(yǎng)皿內(nèi),分別利用以上三種誘變因子在已確定的最佳條件下進行第一次誘變處理。誘變后,將菌液混合均勻,并將其分成兩部分,一部分在30℃、200r/min條件下震蕩培養(yǎng)8h后,利用甘油保藏法進行超低溫冷凍保藏,一部分作為出發(fā)菌株分別在三個誘變因子最佳誘變條件下進行第二次誘變,如同第一次操作,第二次誘變所得菌液也分成兩部分,一部分保藏,另一部分作為出發(fā)菌株進行第三次誘變處理,將所得菌液進行超低溫冷凍保藏。752020年4月19日

25資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。誘變操作完成后,將第一次、第二次、第三次分別保藏的突變菌株進行稀釋,涂布于含有80g/L3-氰基吡啶的篩選培養(yǎng)基上進行菌種篩選,挑選生長狀況良好的菌株轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基在30℃、220r/min條件下進行震蕩培養(yǎng),篩選出高酶活菌株,并進行及時保藏。(5)遺傳穩(wěn)定性測定為保證誘變后菌株的遺傳穩(wěn)定性,減少回復突變對菌株酶活帶來的負面影響,我們需將挑選出來的酶活性最高的3株菌株進行連續(xù)傳代培養(yǎng),每代菌株在30℃條件下培養(yǎng)48h,連續(xù)傳代培養(yǎng)6次,測定每次傳代菌株的酶活,并將遺傳穩(wěn)定性變化圖繪制成曲線圖。根據(jù)遺傳穩(wěn)定性曲線圖挑選出穩(wěn)定性良好的菌株進行保藏,保藏于設定溫度為－70℃的超低溫冰箱中。(6)菌株酶活性測定方法在測定菌株酶活性高低時,我們需要嚴格控制酶反應的時間和參與反應酶的量。我們定義1mL發(fā)酵液在1min內(nèi)催化3-氰基吡啶生成1μmol煙酰胺所需的腈水合酶的數(shù)量定義為一個酶活力單位(U)。測定腈水合酶的酶活時,整個反應過程是在磷酸緩沖液中進行。將發(fā)酵液進行離心,磷酸緩沖液洗滌兩次后,取1mL菌懸液加入到9mL質(zhì)量分數(shù)為8752020年4月19日

26資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。%的3-氰基吡啶溶液,再向混合溶液中加入10mL磷酸緩沖液,混勻后置于30℃條件下震蕩反應5min,反應結(jié)束后用6mol/L鹽酸溶液終止反應。利用HPLC測定腈水合酶的沒活力。2.2.3HPLC檢測煙酰胺條件的優(yōu)化當前在煙酰胺檢測方面最準確的方法是高效液相色譜檢測法。高效液相色譜(HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC)又稱”高速液相色譜”、”高分離度液相色譜”、”高壓液相色譜”。高效液相色譜技術使色譜技術的一個重要分支,其所用的流動相為液態(tài),利用高壓輸液系統(tǒng),將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相進入裝有固定相的色譜柱,在柱內(nèi)完成分離各成分的分離,再經(jīng)檢測器檢測,從而實現(xiàn)對樣品的分析檢測[34]。和其它檢測技術相比,高效液相色譜有以下特點:(1)流動相為液體,在高壓作用下能使各成分快速完成分離。(2)分離效能高。(3)靈敏度高。檢測可達到納米級。(4)應用范圍廣。在有機化合物中,70%的物質(zhì)都能用高效液相色譜法進行檢測分析,特別是高沸點、大分子、強極性、熱穩(wěn)定性差的化合物。(5)分析速度快。一般檢測一般能夠在幾分鐘到幾十分鐘內(nèi)完成,一般不超過一個小時。但高效液相色譜也有其缺點,高效液相色譜具有”柱外效應”。在從進樣到檢測器之間752020年4月19日

27資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。,如果流動相的流型有變化,被分離物質(zhì)的任何擴散和滯留都會顯著地導致色譜峰的加寬和柱效能的降低。當前高效液相色譜作為一種快速、準確、直接的檢測技術已被廣泛應用,特別是在藥品檢測方面。一般藥品成分都比較復雜,特別是中藥成分,檢測難度比較大。利用高效液相色譜技術能夠成功的對許多藥品的具體成分進行分析測定,它也稱為當前藥品檢測采用的主流方法之一。在《中國藥典》中,使用高效液相色譜技術檢測的標準品已從80年代的7種增加到了的余種。在生命科學領域,HPLC當前已成為生物化學家和醫(yī)學家在分子水平研究生命科學、臨床化學、遺傳工程、分子生物學等必不可少的工具,其在生化領域的應用主要集中在兩個方面:(1)低分子量物質(zhì),如氨基酸,有機酸,糖類,卟啉類,有機胺類、維生素類等的分離測定。(2)高分子物質(zhì),如多肽,蛋白質(zhì)、酶、核糖核酸等的純化、分離和測定。關于高效液相色譜檢測,本實驗室當前暫時使用的檢測條件為:檢測所使用的流動相為甲醇和水,其比例為:甲醇:水=1:4,流動相流速為0.3mL/min,檢測樣品進樣量為10μL752020年4月19日

28資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。,色譜柱柱溫為30℃,紫外檢測波長為248nm,色譜柱規(guī)格為C18柱。以上檢測條件均是經(jīng)過預實驗進行確定。在此條件下,煙酰胺和3-氰基吡啶的檢出時間分別為13.776min和25.968min。如圖1-3所示:圖2-1煙酰胺和3-氰基吡啶出峰時間圖Fig.2-1Thepeaktimeofnicotinamideand3-cyanopyridin在實驗過程中,為了獲得更好的檢測結(jié)果,我們需要從各個檢測條件入手,對整個檢測過程進行優(yōu)化處理,以期能在最短的時間內(nèi)檢測出煙酰胺的含量。(1)繪制煙酰胺標準曲線為了確定高效液相色譜檢測過程中檢出峰的峰面積與煙酰胺的含量是否具有良好的線性關系,我們需要繪制煙酰胺標準曲線:配置0.025g/L煙酰胺標準溶液(用0.22nm水系濾膜過濾),設定煙酰胺溶液進樣量分別為5μL、10μL,15μL,20μL,25μL752020年4月19日

29資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。,以煙酰胺進樣量為橫坐標,檢出峰的峰面積為縱坐標繪(2)HPLC紫外檢測波長的確定為了確定煙酰胺檢測波長,我們應對煙酰胺及其生產(chǎn)所用底物3-氰基吡啶進行紫外吸收光譜掃描,確定兩者的紫外吸收峰后,為了得到最佳出峰效果,我們也要考慮在其它紫外波長下煙酰胺的處峰情況,在實驗中,我們選取200nm、220nm、240nm,260nm五個紫外波長進行測定,觀察在每個紫外吸收波長下煙酰胺的出峰情況,經(jīng)過對比,選出最佳峰形所對應的紫外吸收波長作為煙酰胺檢測波長。(3)HPLC流動相流量的確定高效液相色譜檢測所使用的流動相要是根據(jù)被檢測物質(zhì)的溶解性以及極性來確定的。被檢測物質(zhì)在流動相中應該有很好的溶解性,而且要求流動相的洗脫能力要強,再者流動相與稀釋液不應再樣品的紫外吸收波長處有吸收。HPLC檢測過程中,流動相流量的大小會直接影響到檢測保留時間的長短。選擇最佳的流動相流量,不但能優(yōu)化流動相的使用量,更能使檢測時間縮短,檢測效果提高,這對檢測過程有著很重要的影響。在煙酰胺檢測過程中,我們分別設定流動相甲醇和水混合液的流速分別為0.1mL/min、752020年4月19日

30資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。0.2mL/min、0.3mL/min、0.4mL/min、0.5mL/min、0.6mL/min六個不同的流量進行試驗,煙酰胺檢測出峰時間會有不同,我們將出峰時間短、檢測峰峰型最佳的流動相流量作為煙酰胺檢測最適宜流動相流量。(4)高效液相色譜流動相比例的確定煙酰胺的高效液相色譜檢測所使用的流動相為甲醇和水的混合物。有機相的甲醇要求必須是色譜級檢測專用品。水相要求使用超純水,即蒸餾水除去幾乎所有離子雜質(zhì)。流動相中甲醇和水的比例決定了對煙酰胺的洗脫能力及檢測所用時間。因此,確定最佳的流動相比例對于煙酰胺的檢測具有非常重要的意義。在本實驗中,我們設定了流動相的比例分別為甲醇:水=1:7、1:5、1:3、1:1、四個不同流動相比例進行試驗,經(jīng)過出峰時間的不同來確定最佳的流動相比例。2.2.4煙酰胺的提取煙酰胺在固體狀態(tài)下為白色結(jié)晶或者白色結(jié)晶粉末,在水中或者乙醇中有很高的溶解度。根據(jù)煙酰胺的物理性質(zhì),我們設計了煙酰胺的提取過程并得到了煙酰胺的結(jié)晶。煙酰胺生產(chǎn)菌經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)48h后,離心處理3次,每次離心條件為4000r/min、15min,752020年4月19日

31資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。每次離心后棄去上清液并加入蒸餾水與菌體震蕩混勻。離心是為了對菌體進行清洗,充分洗去菌體中的發(fā)酵液成分。取出菌體加入蒸餾水制成菌懸液,取5mL菌懸液加入15mL含有8%的3-氰基吡啶溶液中,在30℃下進行酶反應,反應過程中充分震蕩,并檢測3-氰基吡啶反應情況,當確定3-氰基吡啶已反應完全后,將反應液再次離心,棄去菌體沉淀。將所得上清液進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥后,加入20mL無水乙醇將所得固體溶解。將溶液放入45℃真空干燥箱中干燥后,對所得固體進行檢測,并對煙酰胺的純度及收率進行計算。2.2.5煙酰胺生產(chǎn)過程中酶催化反應條件優(yōu)化在腈水合酶催化生產(chǎn)煙酰胺過程中,我們需要對轉(zhuǎn)化所需的各個條件加以控制,以實現(xiàn)穩(wěn)定高效的生產(chǎn)。煙酰胺生產(chǎn)過程中的腈水合酶催化反應所涉及的條件有:(1)微生物的菌齡。微生物法生產(chǎn)煙酰胺主要利用微生物體內(nèi)的腈水合酶,而微生物的菌齡影響著腈水合酶的活性,因此我們需要在腈水合酶活性最高的微生物生長時間內(nèi)進行轉(zhuǎn)化生產(chǎn)。(2)菌體濃度。為了保證菌體充分與底物接觸,實現(xiàn)底物充分利用,752020年4月19日

32資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。我們需要控制微生物菌體的濃度。菌體濃度過大將會使菌體不能充分接觸底物,導致轉(zhuǎn)化效率降低,菌體濃度過小將會使生產(chǎn)時間延長,降低生產(chǎn)效率。(3)溫度。溫度影響著腈水合酶的酶活性,為了保證菌體在高酶活情況下參加反應,適宜的溫度是不可或缺的。(4)PH。微生物的生長需要適宜的PH,腈水合酶在合適的Ph條件下才能保證較高酶活性。(5)底物濃度。煙酰胺生產(chǎn)所使用的底物3-氰基吡啶為一種劇毒性物質(zhì),底物的毒性會降低微生物活性,從而降低腈水合酶的酶活性,選擇合適的底物濃度,不但能降低底物對腈水合酶的影響,也能保證煙酰胺生產(chǎn)的高效進行.(6)反應時間。隨著酶反應時間的延長,底物的持續(xù)消耗以及產(chǎn)物的不斷積累,腈水合酶的活性也會出現(xiàn)一定的變化。(7)產(chǎn)物濃度。在酶反應過程中,產(chǎn)物的不斷積累會對腈水合酶活性造成抑制效應,從而降低腈水合酶的活性。為了獲得煙酰胺生產(chǎn)最適宜的條件,我們影響腈水合酶活性的因素分別進行試驗,以期確定最佳的生產(chǎn)條件組合。酶催化體系:配置PH7.2的磷酸緩沖液和質(zhì)量分數(shù)為10%的3-氰基吡啶溶液。取發(fā)酵液1mL加入到10mL3-氰基吡啶溶液和9mL磷酸緩沖液混合溶液中,置于30℃下震蕩反應10min,用6mol/L鹽酸溶液終止反應(加入鹽酸溶液0.1mL),8000r/min離心10752020年4月19日

33資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。min,取上清液進行高效液相色譜分析,確定反應體系中煙酰胺含量。(1)最適菌體濃度的確定。將培養(yǎng)48h的發(fā)酵液取20mL在4000r/min條件下離心15min,放入60℃真空干燥箱內(nèi)烘干,測定菌體干重,計算出菌體在發(fā)酵液中的質(zhì)量分數(shù)。在保證其它條件不變情況下,我們先進行預實驗,設定菌體濃度分別為1%、1.5%、2%、2.5%,確定大范圍內(nèi)的最佳菌體濃度,之后在小范圍內(nèi)進行精細優(yōu)化,在確定分別選取菌體濃度為1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2.0%的菌液進行轉(zhuǎn)化反應,反應完成后利用HPLC測定腈水合酶活性,以確定反應所需最適菌種濃度。(2)最佳菌齡的確定。保證其它條件不變,根據(jù)煙酰胺生產(chǎn)菌種的生長曲線,選取菌齡(即發(fā)酵培養(yǎng)時間)分別為30h、36h、42h、48h、54h、60h的菌體進行轉(zhuǎn)化反應,反應完成后測定腈水合酶活性,以確定反應所需最佳菌齡。(2)最適底物濃度的確定。保證其它條件不變,我們進行預實驗,設定底物濃度分別為1%、5%、10%、15%,之后根據(jù)較高腈水合酶活性所對應的底物濃度,我們進行精細優(yōu)化實驗,設定底物3-氰基吡啶分別為7%、8%、9752020年4月19日

34資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。%、10%、11%、12%五個不同的濃度進行轉(zhuǎn)化反應,反應完成后測定腈水合酶活性,以確定反應所需最適底物濃度。(4)最適溫度的確定。保證其它條件不變,在預實驗中,我們將濃度范圍設置為26℃、28℃、30℃、32℃,在此范圍內(nèi)確定高酶活菌株所對應的溫度,之后進行精細優(yōu)化實驗,在實驗中將溫度分別設定為28.5℃、29℃、29.5℃、30℃、30.5℃、31℃五個不同溫度進行轉(zhuǎn)化反應,反應完成后測定腈水合酶活性,以確定反應所需最適溫度。(5)最適PH保證其它條件不變,在預實驗中我們將PH變化范圍設置為6、6.5、7、7.5、8,在此范圍內(nèi)確定較高酶活菌株所對應的溫度,之后進行精細優(yōu)化實驗,在實驗中將PH分別設定為6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8五個不同酸堿度進行轉(zhuǎn)化實驗,反應完成后測定腈水合酶活性,以確定反應所需最適PH。(6)最佳反應時間為了確定反應體系中腈水合酶最佳反應時間,,在保證其它實驗條件不變情況下,設定反應時間分別為10min、20min、30min、40min、50min、60min,反應結(jié)束后測定腈水合酶活性,以確定最佳反應時間。(7)產(chǎn)物濃度對腈水合酶活性的影響為了確定煙酰胺生產(chǎn)過程中煙酰胺的積累對腈水合酶活性的影響,我們在保證其它反應條件不變情況下,在預實驗的基礎上,752020年4月19日

35資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。設定反應體系內(nèi)的煙酰胺濃度分別為40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L,測定不同濃度煙酰胺存在時對腈水合酶活性的影響并繪制曲線。(8)響應面法優(yōu)化腈水合酶催化反應條件響應面法(ResponseSurfaceMethodology,簡稱RSM)是由Box-Wilson在1951年建立的一種數(shù)學方法與統(tǒng)計學方法相結(jié)合的綜合性優(yōu)化分析方法。具體來講,響應面法是利用合理的實驗設計并經(jīng)過實驗得到一些數(shù)據(jù),經(jīng)過對這些數(shù)據(jù)進行多元二次回歸方程分析來得到擬合因素和響應值之間的函數(shù)關系,并尋求出最優(yōu)的工藝參數(shù)。響應面法是用來解決多變量問題的一種主要方法。在微生物發(fā)酵方面,響應面法要求我們進行合理的實驗設計,并在有限的實驗次數(shù)下評價出各個因素對微生物發(fā)酵的影響,進而探索各因素之間的交互作用等,最終求的最佳實驗條件。它是一種快捷有效的統(tǒng)計分析方法。影響腈水合酶催化反應的主要因素有菌齡、底物濃度、溫度、PH、反應時間五個因素,為了確定這五個因素中對煙酰胺產(chǎn)量影響最為顯著的因素,進而經(jīng)過響應面法對顯著影響因素進行分析來獲得最高腈水合酶活性,我們要運用Plackett-Burman設計法來找出顯著影響因素。Plackett-Burman設計法即篩選實驗設計,752020年4月19日

36資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。主要針對因素數(shù)較多且未能確定各個因素對響應變量的顯著影響而采用的實驗設計方法。該方法主要經(jīng)過對各個因素取兩個水平進行分析,經(jīng)過比較各個因子兩水平的差異與整體的差異來確定因子的顯著性。在本實驗中,經(jīng)過對影響腈水合酶活性的五個因素取1和2兩個水平,1代表低水平,2代表高水平,各因素具體水平設計如表2-3所示:表2-3Plackett-Burman實驗設計Tab.2-3DesignofPlackett-Burmanexperiment因素水平12A菌齡(h)3654B反應溫度(℃)2931C反應時間(min)2040D反應PH7.07.8E底物濃度(g/L)80120經(jīng)過Plackett-Burman設計法挑選出顯著影響因素后,以腈水合酶活性為響應值(Y),以顯著影響因素為自變量,進行響應面優(yōu)化實驗。3結(jié)果與討論752020年4月19日

37資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。3.1煙酰胺高產(chǎn)菌株初篩3.1.1ARTP誘變對出發(fā)菌株Norcardiasp.HD9611進行ARTP誘變處理,以誘變時間為自變量,對菌體的致死率進行統(tǒng)計并繪制出菌體致死率曲線,如圖3-1所示:圖3-1ARTP誘變致死率曲線與突變率變化圖Fig.3-1Rateoffatalityandtheratevariationofmutationinmutagenesis由菌體致死率曲線圖我們可知,ARTP誘變處理時間從60s到360s,隨著誘變處理時間的增加,菌體的致死率也隨之上升,當處理時間為180s時,致死率約為80.79%,當處理時間為240s時,致死率約為90.28%,當處理時間增加到300s以上時,菌體致死率接近100%,在平板上幾乎沒有存活菌落出現(xiàn)。752020年4月19日

38資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。經(jīng)過對正負突變率進行統(tǒng)計分析,在誘變時間為180s時,菌體的總突變率和正突變率分別達到63.34%和26.67%,在誘變時間為240s時,菌體總突變率和正突變率分別達到73.33%和43.3%,經(jīng)過比較可知,ARTP誘變時間在240s時,菌體的總突變率相對較大且正突變率較高,因此,選定240s作為ARTP誘變實驗的處理時間。3.1.2微波誘變利用微波對煙酰胺生產(chǎn)菌株進行誘變處理,設定微波照射時間為60s,在相同照射時間下,菌株的致死率與微波照射強度呈一定的函數(shù)關系,如圖3-2所示:圖3-2不同微波強度時致死率曲線與突變率變化圖Fig.3-2Rateoffatalityandratevariationofmutationofdifferentintensityofmicrowave由上圖我們可知,隨著微波照射強度的增強,752020年4月19日

39資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。菌種的致死率持續(xù)增加,當照射強度為100%時,菌種的死亡率達到90%以上,此時在培養(yǎng)過程中平板上生長的菌落極少,經(jīng)過對菌中正負突變率進行統(tǒng)計可知,此時菌株正突變率較低。當微波照射強度為60%時,菌種死亡率為62.54%,此時菌種的總突變率和正突變率分別為10.33%和60.33%,正突變率較高,此時的照射強度有利于我們篩選出腈水合酶活性較高的菌株,因此,在微波照射時間一定的情況下,我們選擇微波照射強度60%作為菌種誘變的最佳處理強度。在微波誘變實驗中,我們確定了最佳微波照射強度為60%,在設定相同微波照射強度情況下,對不同微波照射時間對菌株誘變效果的影響進行實驗,得出菌種致死率曲線及菌種正負突變率變化圖,如圖3-3所示:752020年4月19日

40資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。圖3-3不同微波誘變時間時致死率曲線與突變率變化圖Fig.3-3Rateoffatalityandratevariationofmutationindifferenttimeofmicrowavemutagenesis由上圖我們可知,在微波照射強度同為60%的情況下,菌種死亡率隨著微波照射時間的延長而增高。當照射時間達到180s時,菌種死亡率超過98%,菌株幾乎全部死亡,此時不能挑選出具有正突變的菌株。當照射時間為90s時,菌種死亡率為69.67%,此時誘變菌株具有較高的正突變率,約為6.67%,此時的微波誘變時間對于高產(chǎn)菌株的篩選有益,因此,我們選擇90s作為微波誘變的最佳處理時間。3.1.3EMS誘變經(jīng)過使用EMS這種化學誘變劑對煙酰胺產(chǎn)生菌種進行誘變實驗,我們得到了不同EMS濃度對菌種死亡率的影響,752020年4月19日

41資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。而且經(jīng)過對誘變后菌種正負突變率進行統(tǒng)計,我們得到EMS與三者之間的關系圖,如圖3-4所示:圖3-4不同EMS濃度時致死率曲線與突變率變化圖Fig.3-4RateoffatalityandratevariationofmutationindifferentconcentrationofEMS由上圖我們可知,隨著EMS濃度的不斷增加,菌種的死亡率也不斷增加,當EMS濃度為0.2%時,菌株的死亡率已達到42.27%,說明EMS對微生物菌種具有很強的誘殺效果。當EMS濃度高于1.0%時,菌種死亡率達到96%以上,此時菌株形態(tài)發(fā)生嚴重改變,而且在培養(yǎng)過程中生長出的菌種未出現(xiàn)具有正突變效應的菌株。當EMS濃度為0.8%時,誘變后菌種死亡率為90.22%,752020年4月19日

42資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。菌種死亡率較高,對培養(yǎng)過程中生長出的菌種進行正負突變率統(tǒng)計得出,其正突變率和總突變率約為6.67%和86.67%,此時誘變菌種具有較高的正突變率,這種情況有利于腈水合酶高酶活性菌種的篩選,因此,我們將0.8%作為EMS誘變的最佳菌種處理濃度。3.1.4復合誘變在對菌種進行單因子誘變篩選的基礎上,我們設計了煙酰胺生產(chǎn)菌種的復合誘變實驗。在實驗中,我們選用三種單因子誘變的最佳誘變條件作為復合誘變的實驗條件。復合誘變條件為:等離子體誘變時間240s,微波誘變照射強度和照射時間分別為60%和90s,EMS濃度0.8%。誘變完成后隨機挑選30株菌株在篩選培養(yǎng)基進行培養(yǎng)并轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng),經(jīng)過對各株菌株酶活性進行測定,我們得到誘變后所選菌株腈水合酶活力情況如圖3-5所示:752020年4月19日

43資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。圖3-5復合誘變后腈水合酶的酶活力Fig.3-5Theenzymeactivityofnitrilehydrataseaftercompositemutagenesis由圖我們可知,經(jīng)過復合誘變后,在所選30株菌株中,有5株菌株在篩選培養(yǎng)基中未能生長,這可能是因為這些菌株在經(jīng)過誘變后對于有毒底物3-氰基吡啶的耐受能力下降甚至消失,在底物濃度為80g/L的培養(yǎng)基上不能生長。與未經(jīng)過任何誘變處理的菌株B1相比,在所選的菌株中有4株菌株發(fā)生了正突變,分別為B4、B14、B22、B27,其中B14菌株菌株腈水合酶活力最高,達到1764U,與出發(fā)菌株B1相比,腈水合酶活力提高了33.13%。而B22和B27兩種株菌株也具有較高的酶活性,752020年4月19日

44資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。與出發(fā)菌株相比,兩者酶活性分別提高了20.9%和15.55%。在4株篩選出的高酶活菌株中,我們將酶活最高的B14、B22、B27這3株菌株進行保藏,并對這些菌株的遺傳穩(wěn)定性進行測定。為了確定對高酶活菌株的菌落形態(tài),我們對ARTP處理時間240s對應的平板上的菌落形態(tài)進行觀察統(tǒng)計,如圖3-6所示:圖3-6復合誘變后菌落不同形態(tài)圖Fig.3-6Differentformsofcolonyaftercompositemutagenesis上圖中突變株所對應的菌落形態(tài)共有四種,如表3-1所示:表3-1復合誘變后菌落不同形態(tài)特性Tab.3-1Charactersofdifferentformsofcolonyaftercompositemutagenesis菌落直徑形態(tài)凸起情況濕潤情況14-5mm圓餅狀中部凹陷干燥752020年4月19日

45資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。23.5-4mm圓餅狀輕微凸起較濕潤32.0-2.5mm球狀凸起明顯干燥41.0-1.5mm球狀無干燥分別從篩選培養(yǎng)基上挑選四種菌體形態(tài)的突變株進行發(fā)酵培養(yǎng),并測定其腈水合酶活性,經(jīng)測定,在四種形態(tài)突變菌株的菌落中,第3種形態(tài)的突變株為發(fā)生正突變的突變株,在我們所挑選的B4、B14、B22、B27這4株腈水合酶活力較高菌株在平板培養(yǎng)過程中均表現(xiàn)為此種菌落的性狀。第4種菌落所對應的突變株的腈水合酶活力與初始菌株相比均表現(xiàn)為下降,可能是因為這些菌株發(fā)生了負突變效應。3.1.5突變菌株的遺傳穩(wěn)定性實驗為了檢測高酶活突變株的遺傳穩(wěn)定性,將篩選出來的B14、B22、B27三株突變株進行連續(xù)六次傳代培養(yǎng),考察其遺傳穩(wěn)定性是否良好,如圖3-7所示:752020年4月19日

46資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。圖3-7突變株遺傳穩(wěn)定性變化圖Fig.3-7Thegeneticstabilityofmutantstrain在所挑選的五株高酶活突變株中,B14和B22兩株突變株經(jīng)過多次傳代仍能保持良好的酶活性,可見其遺傳穩(wěn)定性良好,B27兩突變株傳代多次后酶活性持續(xù)下降,其遺傳穩(wěn)定性較差。因此,我們應將B27突變株淘汰,保留腈水合酶活力最高的B14突變株作為我們后續(xù)實驗的最佳菌株,并將B14突變株暫時命名為NHD-1。3.1.6煙酰胺高產(chǎn)菌株NHD-1生長曲線的測定為了更加深入的了解NHD-1在發(fā)酵過程中的生長情況,我們進行了NHD-1生長曲線的測定,如圖3-8所示:752020年4月19日

47資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。圖3-8菌株NHD-1生長曲線圖Fig.3-8ThegrowthcurveofstrainNHD-1由NHD-1生長曲線我們能夠看出,在發(fā)酵培養(yǎng)36h時,菌體的生物量達到最大,之后進入穩(wěn)定期,在發(fā)酵培養(yǎng)48h以后,菌體生物量開始減少,進入衰亡期,因此,在進行發(fā)酵培養(yǎng)時,我們應選擇36h左右作為種子培養(yǎng)時間,由于穩(wěn)定期菌體酶活性能夠維持在較高水平,且此時軍體量較大,我們應挑選培養(yǎng)時間在36h～60h之間的菌種進行后期煙酰胺的生產(chǎn)。3.1.7生長過程中腈水合酶活性的測定腈水合酶是一種誘導酶,因此在NHD-1生長過程中,它的酶活性會受到誘導因子及菌體培養(yǎng)時間的雙重影響,為了了解菌體內(nèi)腈水合酶的活性的變化,752020年4月19日

48資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。我們對整個發(fā)酵過程中腈水合酶活性進行了測定,如圖3-9所示:圖3-9生長過程中NHD-1酶活變化圖Fig.3-9ChangeofenzymeactivityofNHD-1intheprocessofgrowth由圖我們可知,隨著發(fā)酵培養(yǎng)時間的延長,誘導因子鈷離子會逐漸與菌體內(nèi)部腈水合酶結(jié)合,使腈水合酶活性逐漸提高,在培養(yǎng)后期,由于菌體整體活性降低,也會對腈水合酶活性造成影響,因此,發(fā)酵培養(yǎng)后期腈水合酶活性逐漸降低。與出發(fā)菌株相比,突變菌株NHD-1在整個生長過程中都具有較高的腈水合酶活性,且能在更長的一段時間內(nèi)維持在高酶活狀態(tài)。3.1.8實驗小結(jié)本實驗以實驗室保藏菌種Norcardiasp.HD9611為出發(fā)菌株,752020年4月19日

49資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。對其進行ARTP誘變、微波誘變、EMS誘變?nèi)N單因子誘變以及三種因子在最佳誘變條件下的復合誘變,最終確定復合誘變的最佳條件組合為:ARTP誘變時間240s;微波誘變時間90s,微波照射強度60%;EMS濃度0.8%。經(jīng)過誘變篩選,選育出一株酶活為1764U且能夠穩(wěn)定遺傳的腈水合酶高酶活菌株,該菌株與出發(fā)菌株相比,酶活提高了33.13%,并將該菌株暫時命名為NHD-1。經(jīng)過測定其生長曲線,我們確定了利用NHD-1菌株進行煙酰胺生產(chǎn)的最佳接種時間為24h~36h,發(fā)酵穩(wěn)定期為36h~68h。經(jīng)過對NHD-1菌株在生長過程中腈水合酶活性變化曲線,確定了腈水合酶在36h~68h時間內(nèi)能夠維持在較高酶活,在此期間煙酰胺生產(chǎn)效率最高。3.2煙酰胺檢測條件優(yōu)化3.2.1煙酰胺標準曲線繪制利用HPLC進行煙酰胺含量測定時,當煙酰胺濃度一定,HPLC峰面積會隨著進樣量的不同而出現(xiàn)變化,為了確定HPLC煙酰胺濃度與峰面積之間的關系,我們需要繪制煙酰胺標準曲線,如圖3-10所示:752020年4月19日

50資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。圖3-10煙酰胺標準曲線Fig.3-10Thestandardcurveofnicotinamide根據(jù)煙酰胺標準曲線我們可知,煙酰胺含量在0.025～0.0625g/L濃度范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關系,線性回歸方程為Y=985.98X+16350.61R=0.99971。3.2.2HPLC紫外檢測波長的確定為了確定煙酰胺及其底物3-氰基吡啶的紫外吸收峰所在大致范圍,我們對0.1g/L的煙酰胺標準樣品與0.1g/L的3-氰基吡啶標準樣品進行全波長紫外光譜掃描,繪制煙酰胺與3-氰基吡啶的紫外吸收光譜圖,如圖3-11所示:752020年4月19日

51資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。圖3-11煙酰胺與3-氰基吡啶紫外吸收光譜圖Fig.3-11Theultravioletabsorptionspectraofnicotinamideand3-cyanopyridin經(jīng)過紫外吸收光譜圖我們能夠看出,煙酰胺和3-氰基吡啶的最大紫外吸收峰均在在220nm左右,但兩種物質(zhì)在210nm～230nm內(nèi)均有較大吸收值。為了得到HPLC檢測的最佳峰形我們分別對煙酰胺和3-氰基吡啶在紫外波長為200nm、220nm、240nm、260nm處的紫外吸收情況進行測定,如圖3-12所示:752020年4月19日

52資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。圖3-12不同紫外檢測波長下煙酰胺出峰情況Fig.3-12ThepeakvaluesofnicotinamideunderdifferentwavelengthofUVdetection由圖可知,在紫外吸收波長為220nm時,其它物質(zhì)對煙酰胺檢測干擾最小,這與煙酰胺紫外吸收光譜圖是一致的,而且在此處,煙酰胺檢測出峰效果較好,紫外吸收值在0.2～0.8之間,因此我們選擇220nm作為煙酰胺檢測最佳紫外吸收波長。3.2.3HPLC流動相流量的確定在HPLC流動相流量分別為0.2mL/min、0.3mL/min、0.4mL/min、0.5mL/min幾個不同流量時,我們分別對煙酰胺進行進樣檢測,觀察其出峰時間的變化。如圖3-13所示:752020年4月19日

53資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。圖3-13不同流動相流量下煙酰胺出峰情況Fig.3-13Thepeakvaluesofnicotinamideunderdifferentflowofmobilephase經(jīng)過對比我們可知,當HPLC流動相流量從0.2mL/min依次遞增到0.5mL/min時,煙酰胺出峰時間分別為13.524min、11.389min、7.812min、9.796min,且檢測峰的峰形在0.4mL/min和0.5mL/min時均較好,因此,我們根據(jù)出峰時間長短確定HPLC檢測流動相最佳流量為0.4mL/min。3.2.4HPLC流動相比例的確定在HPLC流動相中甲醇:水的比例分別為1:7、1:5、1:3、1:1四個不同流動相比例時,對煙酰胺分別進行進樣檢測,觀察其出峰時間變化情況。如圖3-14所示:752020年4月19日

54資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。圖3-14不同流動相流量比例下煙酰胺出峰情況Fig.3-14Thepeakvaluesofnicotinamideunderdifferentproportionofmobilephase經(jīng)過對比我們可知在流動相中甲醇:水的比例從1:7依次變化到1:1時,煙酰胺出峰時間分別為12.883min、5.306min、3.962min、8.769min,且在流動相比例為1:7、1:5和1:3時均有較好的分離效果,因此,根據(jù)檢測出峰時間的長短,我們選定流動相中甲醇:水的最佳比例為1:3。3.2.5HPLC檢測最佳條件根據(jù)對HPLC檢測的紫外檢測波長、流動相流量、流動相比例三個條件進行的單因素優(yōu)化實驗,我們能夠確定煙酰胺檢測最佳條件為:紫外檢測波長為220nm,流動相流量為0.4mL/min,流動相中甲醇:水=1:3。3.3煙酰胺提取在實驗過程中,經(jīng)過對發(fā)酵液進行重復萃取,752020年4月19日

55資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。我們獲得了煙酰胺結(jié)晶,為白色粉末狀固體,如圖3-15所示:圖3-15產(chǎn)物提取后煙酰胺成品圖片F(xiàn)ig.3-15Nicotinamideafterextraction為了確定煙酰胺提取的純度及收率,我們對所獲得的煙酰胺樣品進行HPLC檢測,如圖3-16所示:圖3-16提取后產(chǎn)物與煙酰胺標品檢測結(jié)果Fig.3-16Thetestresultsofthenicotinamideafterextractionandthestandardproductofnicotinamide經(jīng)過與煙酰胺標品進行對,752020年4月19日

56資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。我們計算出提取的煙酰胺樣品的純度為99.11%,在提取過程中煙酰胺收率為95.57%。3.4煙酰胺生產(chǎn)過程中酶催化反應條件優(yōu)化3.4.1菌體濃度的確定當菌體濃度分別為1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2.0%時,對反應體系中腈水合酶的活性進行測定,結(jié)果如圖3-17所示圖3-17不同菌體濃度下腈水合酶活性Fig.3-17Enzymeactivityofnitrilehydrataseunderdifferentbacterialconcentration由圖可知,隨著反應體系中加入菌體量的增加,腈水合酶的酶活性幾乎呈線性增加,這是由于依據(jù)酶促反應動力學的基本原理,在一定范圍內(nèi)保證底物過量時,752020年4月19日

57資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。作為生物催化劑的酶的活性會隨著酶量的增大而增加。在本實驗中,當?shù)孜?-氰基吡啶濃度受到限制時,腈水合酶活性的增加會出現(xiàn)最高值。當具體濃度達到1.8%時,隨著菌體濃度的增加,腈水合酶活性不在升高,腈水合酶酶活穩(wěn)定在1745U左右。這可能是因為在反應過程中底物3-氰基吡啶在反應過程中過量消耗,限制了腈水合酶活性的升高,表現(xiàn)為腈水合酶活性不再隨著酶量的增加而變化。在實際應用中,為了保證煙酰胺生產(chǎn)能夠保持較高的生產(chǎn)速率,我們選擇1.8%作為酶催化反應的最菌體濃度。3.4.2菌齡的確定當參與酶催化反應的煙酰胺生產(chǎn)菌種的菌齡分別為30h、36h、42h、48h、54h、60h時,對反應體系中腈水合酶的活性進行測定,結(jié)果如圖3-18所示:752020年4月19日

58資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。圖3-18不同菌齡下腈水合酶活性Fig.3-18Enzymeactivityofnitrilehydrataseunderdifferentfungusage由圖可知,當菌齡為48h時,腈水合酶活性為1768U,菌體處于其它菌齡時腈水合酶活性都較低,原因是在菌體生長過程中,發(fā)酵液中的誘導因子鈷離子會對菌體內(nèi)的腈水合酶發(fā)揮誘導作用,使腈水合酶具有酶活性。當菌體生長到穩(wěn)定期時,鈷離子對腈水合酶誘導作用完成,腈水合酶的活性達到最高,之后會隨著菌體的衰亡而使腈水合酶活性降低。因此,我們應選擇48h為酶催化反應的最佳菌齡。3.4.3底物濃度的確定當在酶催化過程中所使用的3-氰基吡啶的濃度分別為7%、8%、9%、10%、11%、12%時,對反應體系中腈水合酶的活性進行測定,結(jié)果如圖3-19所示:752020年4月19日

59資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。圖3-19不同底物濃度下腈水合酶活性Fig.3-19Enzymeactivityofnitrilehydrataseunderdifferentconcentrationofsubstrate由圖可知,當3-氰基吡啶濃度低于100g/L時,腈水合酶活性會隨著3-氰基吡啶濃度增加而增加,因為當參與反應的腈水合酶的量一定時,酶反應速率會隨著底物濃度的增加而增加;當3-氰基吡啶濃度為100g/L時,腈水合酶活性達到最大值,為1764U;隨著3-氰基吡啶濃度的繼續(xù)增加,腈水合酶活性會出現(xiàn)降低,原因是作為底物的3-氰基吡啶是一種劇毒物質(zhì),高濃度的3-氰基吡啶會嚴重影響菌體活性,從而使得腈水合酶活性降低,酶催化反應速率降低。因此,我們應該選擇100g/L作為酶催化反應的最佳底物濃度。3.4.4溫度的確定752020年4月19日

60資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。當靜息細胞參與的反應體系溫度分別為28.5℃、29℃、29.5℃、30℃、30.5℃、31℃時,對酶催化反應中腈水合酶的活性進行測定,結(jié)果如圖3-20所示:圖3-20不同溫度下腈水合酶活性Fig.3-20Enzymeactivityofnitrilehydrataseunderdifferenttemperature由圖可知,當反應體系溫度為29.5℃時,腈水合酶活力達到最大值1767U,選用其它溫度時腈水合酶活性均有所降低,原因是腈水合酶是一種溫度敏感型生物催化劑,溫度的變化會對腈水合酶活性產(chǎn)生較大程度的影響由上圖我們能夠確定腈水合酶存在的最適溫度為29.5℃,在此溫度下腈水合酶活性達到最高,此時煙酰胺轉(zhuǎn)化速率也達到最高。因此,我們應選擇29.5752020年4月19日

61資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除?！孀鳛闊燉０飞a(chǎn)的最適溫度。3.4.5PH的確定當靜息細胞參與的反應體系的PH分別為6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8時,對反應體系中腈水合酶的活性進行測定,結(jié)果如圖3-21所示:圖3-21不同PH下腈水合酶活性Fig.3-21EnzymeactivityofnitrilehydrataseunderdifferentPH由圖可知,當反應體系PH為7.4時,腈水合酶的酶活性最高,為1766U,在其它PH條件下,腈水合酶活性都會出現(xiàn)降低,原因是酶的存在需要一定的酸堿度條件要求,只有在其最適PH條件下酶活性才能達到最大。因此,我們選擇7.4作為酶催化反應的最適PH。3.4.6最佳反應時間當酶催化反應的反應時間分別為10min、20min、30min、752020年4月19日

62資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。40min、50min、60min時,在酶催化反應完成后終止反應,對腈水合酶的活性進行測定,結(jié)果如圖3-22所示:圖3-22不同反應時間下腈水合酶活性Fig.3-22Enzymeactivityofnitrilehydrataseunderdifferentreactingtime由上圖可知,在底物充分且參與反應的酶量一定時,腈水合酶活性會在一定范圍內(nèi)隨著反應時間的延長而升高,在反應時間設定為30min時,腈水合酶的活性達到最高,為1772U,這是因為在酶催化反應中,根據(jù)酶催化動力學基本原理,參與反應的腈水合酶的活性會在底物充分的情況下隨著反應的進行而升高,可是隨著底物的不斷消耗,在反應的后期腈水合酶活性會出現(xiàn)下降。因此,根據(jù)這一原理,752020年4月19日

63資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。在實驗中應將30min作為酶催化反應的最佳反應時間。3.4.7煙酰胺濃度對腈水合酶活力的影響當向酶催化反應體系中加入濃度分別為40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L的煙酰胺時,參與酶催化反應的腈水合酶變化情況如圖3-23所示:圖3-23不同煙酰胺濃度下腈水合酶活性Fig.3-23Enzymeactivityofnitrilehydrataseunderdifferentconcentrationofnicotinamide由上圖可知,在酶催化反應過程中,向反應體系內(nèi)加入不同濃度的產(chǎn)物,會對腈水合酶的酶活性產(chǎn)生極大影響。隨著產(chǎn)物煙酰胺濃度不斷加大,其對酶催化速率的抑制效應也更為顯著,當煙酰胺濃度高于60g/L時,腈水合酶的酶活會隨著產(chǎn)物的不斷積累而急劇降低。因此,752020年4月19日

64資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。在發(fā)酵過程中,為了保持腈水合酶能維持較高的催化速率,我們應在發(fā)酵過程中及時對產(chǎn)物進行分離。3.4.8響應面法優(yōu)化煙酰胺生產(chǎn)條件(1)Plackett-Burman實驗法確定顯著影響因素為了分析單因素實驗中五個影響因子的腈水合酶的酶活性影響的顯著性,我們進行了Plackett-Burman實驗設計,如表3-2所示:表3-2Plackett-burman實驗設計Tab.3-2TheexperimentaldesignofPlackett-burman試驗號A菌齡(h)B溫度(℃)C反應時間(min)D反應PHE底物濃度(g/L)Y酶活(U)122222165721121116093212221611411212155351212216906122211778721112147681112116699211211617101111214721122211170412211111648752020年4月19日

65資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。利用SAS軟件對五個影響因子的主效應進行分析,結(jié)果如表3-3所示:表3-3各影響因素顯著性分析Tab.3-3Thesignificantanalysisofthefactorsaffecting因子ABCDE自由度11111F值0.1911.431.166.7817.96Pr＞F0.67930.01480.32200.04040.0055由此表可知,影響腈水合酶的酶活性的五個因素的顯著性為E＞B＞D＞C＞A,即底物濃度＞溫度＞PH＞反應時間＞菌齡,經(jīng)過分析得出,底物濃度、溫度、PH這三個因素對腈水合酶的酶活性影響極其顯著。因此,我們選擇底物濃度、溫度、PH這三個因素進行響應面優(yōu)化實驗。(2)響應面優(yōu)化設計在進行響應面設計時,我們需要確定三個顯著影響腈水合酶的活性的因素及其各自的三個水平,如表3-4所示:表3-4響應面優(yōu)化設計中各因素水平Tab.3-4Levelsofthefactorsintheoptimizingdesignofresponsesurface因素水平-101752020年4月19日

66資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。A底物濃度(g/L)90100110B反應溫度(℃)28.529.530.5PH7.07.47.8響應面設計如表3-5所示:表3-5響應面優(yōu)化設計設計Tab.3-5Theoptimizingdesignofresponsesurface試驗號ABCY酶活(U)1-1-1017002-110171031-1016034110162550-1-1165960-111715701-11720801117359-10-116541010-1157711-1011673121011665130001782140001772150001793(3)響應面優(yōu)化分析使用SAS軟件對實驗結(jié)果進行多回歸分析,響應分析圖如圖3-24所示:752020年4月19日

67資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。752020年4月19日

68資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。圖3-24優(yōu)化結(jié)果響應分析圖Fig.3-24Responseanalysisoftheoptimizatingresults利用SAS軟件進行統(tǒng)計分析所得主要分析結(jié)果如表3-6所示:表3-6SAS統(tǒng)計分析主要結(jié)果Tab.3-6MainresultsofSASstatisticalanalysis參數(shù)來源自由度方差均方差F值Pr＞FX112080.1252080.1253.3939980.124781X21136.125136.1250.2221060.657286X31180018002.9369370.147244X12121702.5621702.5635.41060.001916X2212528.1032528.1034.1249330.097987X3218835.1038835.10314.415640.01267X1X21115611561.8861660.228019X1X3130.2530.250.0493570.832976X2X31420.25420.250.6856930.445345模型935303.183922.5766.40020.027378誤差項53064.417612.8833總誤差項1438367.692.01%R2從上表可知,參數(shù)中的一次項和二次項對響應值均有顯著的影響,而各因素之間的交互項對響應值影響不顯著,因此可忽略交互作用對實驗結(jié)果的影響。利用SAS軟件對實驗結(jié)果完成多元回歸分析后我們得出了個影響因素與響應值之間的多元擬合回歸方程:Y1=1782.333–16.125X1+4.125X2+15X3–76.66667X12-26.16667X22–48.91667X32752020年4月19日

69資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。(4)腈水合酶催化反應最佳條件的確定。經(jīng)過對回歸模型進行極值分析和計算,我們得到了腈水合酶催化反應的最佳條件為:底物濃度98.88g/L,反應溫度29.59℃,PH值7.46,此時,腈水合酶的最高酶活性達到1784.47U。(5)回歸模型驗證經(jīng)過回歸模型分析,我們得到了腈水合酶催化反應的最佳條件組合以及理論上腈水合酶的最高酶活,此后,我們需要經(jīng)過實驗對回歸模型分析結(jié)果進行驗證。利用模型分析所得的最佳條件組合進行實驗設計,重復三次,對實驗中腈水合酶活性進行統(tǒng)計,三次實驗結(jié)果如圖3-25所示:圖3-25回歸模型分析結(jié)果驗證752020年4月19日

70資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。Fig.3-25Verificationoftheanalysisresultsofregressionmodel從表中可知,在實驗過程中腈水合酶的酶活為1775U,這與響應面優(yōu)化過后得出的理論酶活1784U比較吻合,說明回歸分析方程具有很好的擬合度,響應面實驗法對煙酰胺生產(chǎn)菌酶催化反應條件優(yōu)化具有很好的優(yōu)化效果。3.4.9實驗小結(jié)對腈水合酶參與煙酰胺生產(chǎn)過程中酶催化反應條件進行單因素優(yōu)化實驗,我們得出各因素的最佳條件為:菌體濃度1.8%,菌齡48h,底物濃度100g/L,溫度29.5℃,PH7.4,反應時間30min,在實際發(fā)酵后期應該對產(chǎn)物煙酰胺進行及時分離。經(jīng)過Plackett-Burman實驗設計我們分析出底物濃度、溫度和PH這三個因素對腈水合酶的酶活有及其顯著的影響;經(jīng)過對這三個因素進行響應面優(yōu)化設計,我們得出了這三個因素的最佳條件組合為底物濃度98.88g/L,反應溫度29.59℃,PH值7.46。此時腈水合酶最高酶活為1784U。對SAS軟件統(tǒng)計分析結(jié)果進行三次驗證實驗,我們得到腈水合酶的實際酶活為1775U,與多元回歸分析所得理論值吻合,說明響應面法對煙酰胺生產(chǎn)條件具有很好的優(yōu)化效果。3.5結(jié)論752020年4月19日

71資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。經(jīng)過對以上實驗進行總結(jié),我們能夠得出以下結(jié)論:(1)本實驗以實驗室保藏的諾卡氏菌HD1220為出發(fā)菌株,對其進行ARTP誘變、微波誘變、EMS誘變?nèi)N單因子誘變以及三種因子在最佳誘變條件下的復合誘變,最終確定復合誘變的最佳條件組合為:ARTP誘變時間240s;微波誘變時間90s,微波照射強度60%;EMS濃度0.8%。經(jīng)過誘變篩選,選育出一株酶活為1764U且能夠穩(wěn)定遺傳的腈水合酶高酶活菌株,該菌株與出發(fā)菌株相比,酶活提高了33.13%,并將該菌株暫時命名為NHD-1。(2)利用HPLC對煙酰胺進行檢測,經(jīng)過對HPLC檢測的紫外檢測波長、流動相流量、流動相比例三個條件進行的單因素優(yōu)化實驗,最終確定了確定煙酰胺檢測最佳條件為:紫外檢測波長為220nm,流動相流量為0.4mL/min,流動相中甲醇:水=1:3。在以上條件下,煙酰胺出峰時間為5.306min,與條件優(yōu)化前相比,煙酰胺出峰時間明顯縮短。(3)對腈水合酶參與煙酰胺生產(chǎn)過程中酶催化反應條件進行單因素優(yōu)化實驗,我們得出各因素的最佳條件為:菌體濃度1.8%,菌齡48h,底物濃度100g/L,溫度29.5℃,PH7.4,反應時間30min,在實際發(fā)酵后期應該對產(chǎn)物煙酰胺進行及時分離。經(jīng)過Plackett-Burman實驗設計我們分析出底物濃度、752020年4月19日

72資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。溫度和PH這三個因素對腈水合酶的酶活有及其顯著的影響;經(jīng)過對這三個因素進行響應面優(yōu)化設計,我們得出了這三個因素的最佳條件組合為底物濃度98.88g/L,反應溫度29.59℃,PH值7.46。此時腈水合酶最高酶活為1784U。對SAS軟件統(tǒng)計分析結(jié)果進行三次驗證實驗,我們得到腈水合酶的實際酶活為1775U,與多元回歸分析所得理論值吻合,說明響應面法對煙酰胺生產(chǎn)條件具有很好的優(yōu)化效果。展望煙酰胺(Nicotinamide)化學名稱為煙堿酰胺、維生素B3。煙酰胺在生物體內(nèi)與核糖、磷酸基、腺嘌呤形成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(輔酶Ⅰ)和煙酰胺腺嘧啶二核苷酸(輔酶Ⅱ),參與生物體內(nèi)糖原分解、脂類代謝及各種物質(zhì)的氧化作用。煙酰胺作為商品有三種規(guī)格:醫(yī)藥級、食品級和飼料。煙酰胺最主要在飼料中作為營養(yǎng)添加劑,也用作食品、醫(yī)藥中間體向人體提供所需維生素物質(zhì),同時用作電鍍液的添加劑和生化試劑。煙煙酰胺應用最廣泛的應用是在飼料工業(yè),其作為重要的飼料添加劑而被大量應用。當前全世界對煙酰胺的需求量正在與日俱增,因此,752020年4月19日

73資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。從各個方面提高煙酰胺的產(chǎn)量具有重要的意義。在實驗室條件下,為了進一步提高煙酰胺的產(chǎn)量,我們從如何進一步提高煙酰胺生產(chǎn)菌株的腈水合酶的酶活性方面入手,計劃進行如下幾個方面的研究:(1)在現(xiàn)有高酶活煙酰胺生產(chǎn)菌株的基礎上,對菌株繼續(xù)進行誘變篩選,經(jīng)過采用新的誘變因子以及新的復合誘變方法來誘變篩選出具有更高腈水合酶活力的煙酰胺生產(chǎn)菌株。(2)對現(xiàn)有高酶活煙酰胺生產(chǎn)菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化而且擴大培養(yǎng)規(guī)模,利用5L和30L發(fā)酵罐對現(xiàn)有菌種進行發(fā)酵培養(yǎng),經(jīng)過對發(fā)酵罐培養(yǎng)各個條件進行優(yōu)化以及在發(fā)酵過程中對培養(yǎng)基進行補料操作來進一步提高煙酰胺產(chǎn)量。(3)進一步探究腈水合酶的催化性質(zhì),從酶催化動力學角度進行深入研究,跟深入的了解腈水合酶各種特性并實現(xiàn)對酶反應過程的精確調(diào)控。(4)進一步研究煙酰胺的提取工藝,在發(fā)酵液的基礎上,深入研究發(fā)酵液中煙酰胺的提取工藝,以期用最簡潔的提取流程得到煙酰胺的純品。(5)探索更為簡單的煙酰胺檢測方法,從煙酰胺的各種理化性質(zhì)入手,752020年4月19日

74資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。嘗試探索煙酰胺特有的顏色反應進行紫外檢測或者利用沿線那與某物質(zhì)的絡合反應進行紅外檢測,以期得到除了HPLC檢測方法外更為簡單的檢測手段。752020年4月19日