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1、重組木聚糖酶XynAHJ3的酶學(xué)性質(zhì)研究姓名:劉治敏 專業(yè):生物技術(shù)指導(dǎo)教師:李俊俊摘要：本文主要介紹重組木聚糖酶XynAHJ3的酶學(xué)性質(zhì)以及應(yīng)用。結(jié)果表明：該木聚糖酶XynAHJ3的最適反應(yīng)溫度為70℃，在20℃和80℃下都具有酶活性；60℃下XynAHJ3的半衰期60min，70℃下很快失活；酶反應(yīng)最適反應(yīng)pH為6.0，在pH12.0時(shí)仍具有25%以上的酶活；經(jīng)pH4.0–11.0的緩沖液處理1h，酶活剩余90%以上；10mM的Ag+和Hg2+可完全抑制XynAHJ3；Fe3+、Cu2+、Mn2+、Pb2+及10%（v/v）乙醇對(duì)XynA
2、HJ3的抑制較強(qiáng)；Zn2+、Co2+及Fe2+對(duì)XynAHJ3的抑制較弱（剩余酶活>60%）；β-mercaptoethanol可使XynAHJ3的酶活提高~0.3倍；其余金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)XynAHJ3的影響很小，10mM及100mM的SDS未能使XynAHJ3失活。關(guān)鍵詞：木聚糖酶；酶學(xué)性質(zhì)；酶活前言：木聚糖是一種多聚五碳糖，是植物細(xì)胞中主要的半纖維素成分。木聚糖酶是可將木聚糖降解成低聚木糖和木糖的水解酶。一個(gè)木聚糖分子的完全酶解需要幾步酶促反應(yīng)，其中作用于主鏈的酶有兩種：β-1，4-木聚糖酶和β-木糖苷酶。一般而言，前者從主鏈內(nèi)部作用于
3、木糖苷鍵，將木聚糖分解成低聚木糖，而后者則作用于低聚木糖的末端，釋放出木糖[1]。對(duì)木聚糖酶的研究早在60年代就已開始，已經(jīng)從不同來(lái)源的微生物中分離到大量的不同類型不同性質(zhì)的木聚糖酶[2]。木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)決定了其在應(yīng)用上的潛力及應(yīng)用領(lǐng)域，一般要求木聚糖酶有較高的催化效率、較好的抗逆性、較廣的pH和溫度適應(yīng)范圍等。近年來(lái)，大量有關(guān)木聚糖酶結(jié)構(gòu)與功能的研究不斷展開,一方面加深了對(duì)木聚糖酶作用的分子機(jī)理的了解,另一方面為通過基因工程和蛋白質(zhì)工程改良木聚糖酶的性質(zhì)、研制出符合不同應(yīng)用領(lǐng)域要求的木聚糖酶產(chǎn)品提供了指導(dǎo)?，F(xiàn)在已知能夠產(chǎn)生木聚糖酶的菌種包
4、括細(xì)菌、真菌、黑曲酶、木霉等，不同來(lái)源的木聚糖酶的催化特性是有差異的,有不同的最適pH和最適作用溫度，金屬離子對(duì)不同來(lái)源的木聚糖酶活性的影響各不相同[3-4-5]。從產(chǎn)木聚糖酶的菌種的篩選，目的基因的提取以及轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)，用IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)酶，酶的提純，最后進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定，其一序列的流程目的是為了獲得木聚糖酶的高產(chǎn)菌株，有望應(yīng)用于食品及飼料等產(chǎn)業(yè)，為更好的服務(wù)社會(huì)。對(duì)實(shí)驗(yàn)室木聚糖酶XynAHJ3整個(gè)獲取流程有一定的了解，本文重點(diǎn)是對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)的研究。91實(shí)驗(yàn)材料1.1菌株菌種：Lechevalieriasp.HJ3，實(shí)驗(yàn)室保存表達(dá)載體：
5、pET28a（+），表達(dá)菌株：大腸桿菌BL21（DE3）工程菌：實(shí)驗(yàn)室已前期構(gòu)建1.2培養(yǎng)基LB：1％tryptone，0.5％yeastextract，1％NaCl。121℃高壓滅菌30min。1.3試劑配制(1)DNS溶液：稱取6．3g3，5-二硝基水楊酸和262mL2mol/L的NaOH，加到500mL含有182g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5g重蒸酚和5g亞硫酸鈉于其中，攪拌溶解，冷卻后定容到入1000mL，溶液為黃色，室溫存放在棕色瓶中，至少一周后方可使用。(2)D(+)-木糖溶液：lg木糖溶解于pH值為7．0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖
6、液上述中，定容至100mL，室溫下保存。(3)0.05mol／L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(4)0.05mol／LTris-HCl緩沖液(5)O.05mol／LGly-NaOH緩沖液(6)0.5％木聚糖底物溶液：2.5g樺木木聚糖溶解于pH值為7.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中，定容至500mL，室溫下保存。(7)10mM的金屬離子化合物、螯合劑(EDTA)和表面活性劑(SDS)(水對(duì)照)的緩沖液。1.4實(shí)驗(yàn)儀器型號(hào)生產(chǎn)廠家(1)分析天平PL203梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司(2)離心機(jī)Centrifuge5418德國(guó)eppendorf公司
7、(3)高速冷凍離心機(jī)Centrifuge5810R德國(guó)eppendorf公司(4)分子水浴鍋HAAKEDC10德國(guó)HAAKE公司(5)滅菌鍋TDGC2-3天正集團(tuán)有限公司(6)振蕩器(7)pH儀(8)分光光度計(jì)(9)移液槍，錐形瓶，容量瓶，試管若干92實(shí)驗(yàn)方法2.1重組木聚糖酶XynAHJ3酶活力測(cè)定木聚糖酶在一定條件（pH7.0，37℃)下，催化水解底物木聚糖生成木糖等還原糖，還原糖又同DNS試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，用分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度，計(jì)算酶活力。酶活力單位定義：在37℃,pH7.0條件下，每mL待測(cè)酶液每min催化底物生成1μmol木糖所需
8、的酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。(1)木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別吸取l0mmol／ml木糖標(biāo)準(zhǔn)液0、25、50、100、150、200μl，放于六只帶塞的磨
