兔抗人紅細(xì)胞免疫血清的制備

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1、兔抗人紅細(xì)胞免疫血清的制備摘要：目的制備兔抗人紅細(xì)胞免疫血清并鑒定其效價。方法將經(jīng)過生理鹽水洗滌、離心、去上清后配成的紅細(xì)胞懸液皮下多點（10處）注射于家兔靠近淋巴結(jié)處，在20天內(nèi)經(jīng)過免疫間隔時間的不同后，心臟采血并分離血清，倍比稀釋、經(jīng)過滅火補(bǔ)體與不滅活補(bǔ)體的凝集試驗和溶血試驗來判斷兔抗人紅細(xì)胞免疫血清的效價。結(jié)果凝集試驗在(++)1:64抗血清稀釋處出現(xiàn)凝集,溶血試驗在1:512稀釋處出現(xiàn)少量凝集。結(jié)論在凝集試驗中抗血清的效價為1:64.關(guān)鍵詞：兔抗人紅細(xì)胞血清凝集試驗抗體分子是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域用途最廣泛的蛋白質(zhì)分子，抗體作為疾病預(yù)防

2、、診斷和治療的重要生物制劑已有百余年歷史。抗體在醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域中的應(yīng)用日趨廣泛，地位越來越重要，而抗體的制備技術(shù)也是眾多研究者們關(guān)注的問題，目前制備多克隆抗體主要是通過免疫動物所得，但是怎樣才能制備得到高效價的抗體呢，免疫血清效價的高低受多重因素的的影響，免疫的途徑及免疫的時間不同和分離的徹底與否都會影響抗血清的效價。本組通過免疫時間的不同來免疫家兔，并用凝集實驗和溶血試驗來判斷抗體效價，快速經(jīng)濟(jì)的制備抗血清制備方法為實驗教學(xué)使用提供幫助，更好的了解和加深抗原抗體反應(yīng)及抗體效價的鑒定和影響因素。1材料和方法1.1實驗對象選用健康、適齡、

3、健壯、無感染的家兔1.2實驗材料生理鹽水人紅細(xì)胞采血針止血帶碘液酒精棉簽真空管水平式離心機(jī)水浴箱注射器試管吸管實驗分組三個大組（1個班一個大組）4人一組實驗過程和方法一、顆粒性抗原的制備（2%~5%RBC的制備）（1）靜脈采血2-3ml，注入抗凝管中，輕輕混勻。（2）洗滌RBC將上述抗凝血移至10ml試管中，加入NS6-7ml，混勻，2500r/min離心5min,去上清。重復(fù)上述操作三次，最后一次去上清后，將紅細(xì)胞配制成2%~5%的RBC懸液。二免疫家兔2、取上述RBC懸液1ml免疫家兔。免疫部位：靜脈、皮內(nèi)、皮下等。每只兔子免疫8~1

4、0點，每點0.1ml左右。每隔2~4天免疫一次。1班免疫時間表：從11月1日起開始免疫共20天每隔2天免疫一次第一次：11月1日第二次：11月4日第三次：11月7日第四次：11月10日第五次：11月13日第四次：11月16日第七次：11月19日2班免疫時間表:每隔3天免疫一次第一次：11月2日第二次：11月6日第三次：11月10日第四次：11月14日第五次：11月18日第六次：11月21日3班免疫時間表：每隔4天免疫一次第一次：11月3日第二次：11月8日第三次：11月13日第四次：11月18日第五次：11月22日三、對已免疫的家兔心臟采

5、血和分離血清3、心臟采血10ml，凝固后，分離血清（2000轉(zhuǎn)/min,5分鐘)。4、取兩支小試管并以A、B標(biāo)記之，將上述血清一半加入A管，另一半加入B管。將A管置于56℃水浴箱30分鐘（滅活補(bǔ)體）。5、抗血清效價的鑒定。凝集試驗和溶血反應(yīng)凝集反應(yīng)實驗原理指顆粒性抗原(RBC)與相應(yīng)抗體特異結(jié)合，在適當(dāng)電解質(zhì)存在下，形成肉眼可見的凝集現(xiàn)象試管凝集試驗過程1.取潔凈小試管10支，排列于試管架上，依次編號。2.向各管中加入生理鹽水200ul。3.向第一支試管中加入A管血清200ul，充分混勻，吸出200ul放入第二管，混勻后取出200ul加入

6、第三管中，如此類推直至第七管，混勻后取出200ul棄去。第10管不加血清，為生理鹽水對照管。至此，第1~9管的血清稀釋度分別為：1：2，1：4，1：8……1：512。這種稀釋方法稱為連續(xù)倍比稀釋法，為免疫試驗中常用的稀釋方法。4.向每管加入200ul2%RBC懸液，此時每管的液體總量為400ul，血清稀釋度又增加1倍。5.搖勻，置37℃30min。(取出試管1500r/s30秒)觀察結(jié)果。試管凝集操作程序(倍比稀釋法)管號12345678910NS200200200200200200200200200200血清20020020020020

7、0200200200200200RBC200200200200200200200200200200終稀釋度1/41/81/161/321/641/1281/2561/5121/1024----[結(jié)果判斷選擇適當(dāng)?shù)墓獍祵Ρ缺尘?，先不要振搖，觀察管底凝集物的范圍和上清液的濁度。然后輕輕搖動試管，注意觀察凝集顆粒的大小、均勻度等。每一試管的觀察，都應(yīng)與對照管進(jìn)行比較。鹽水對照管誚無凝集現(xiàn)象，輕輕搖動試管則RBC分散成均勻混濁；而凝集塊則沉于管底，輕搖時不易散開，凝集程度通常以“+”表示：“4+”很強(qiáng)，全部RBC凝集，凝集塊全部沉于　　　管底，液

8、體澄清?！?+”強(qiáng)，RBC大部分凝集并沉于管底，液體稍混濁。“2+”中等強(qiáng)度，RBC大約一半凝集，液體較混濁?！?”弱，僅少量RBC凝集，液體明顯混濁?！?-”不凝集，液體混濁與對照管相同。只