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《3種兔艾美耳球蟲rdnaits序列測定與系統(tǒng)進化分析》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、·３０·生物技術(shù)中國畜牧獸醫(yī)２０１４年第４１卷第１２期３種兔艾美耳球蟲ｒＤＮＡＩＴＳ序列測定與系統(tǒng)進化分析許家園１，廖貴城２，胡會朋１，陳曉珍１，劉麗丹２，吳松明２，溫遠輝２，劉園２，翁亞彪１，林瑞慶１（１．華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州５１０６４２；２．佛山正典生物技術(shù)有限公司，廣東佛山５２８１３８）摘要：為研究內(nèi)轉(zhuǎn)間隔區(qū)（ＩＴＳ）序列能否作為鑒別不同種兔球蟲的分子標記，本試驗以兔腸艾美耳球蟲、黃艾美耳球蟲和大型艾美耳球蟲為研究對象，對其核糖體ＤＮＡ（ｒＤＮＡ）ＩＴＳ全序列進行ＰＣＲ擴增，擴增產(chǎn)物純化后連接至ｐＧＥＭ－ＴＥａｓｙ載體上，重組質(zhì)粒通過菌液ＰＣＲ鑒
2、定后測序，將測序結(jié)果與ＧｅｎＢａｎｋ中公布的兔球蟲ＩＴＳ序列進行同源性比對，用Ｍｅｇａ５．０繪制系統(tǒng)進化樹。結(jié)果顯示，兔腸艾美耳球蟲、黃艾美耳球蟲和大型艾美耳球蟲ＩＴＳ序列長度分別為１０６５、１００９和１０４７ｂｐ，與ＧｅｎＢａｎｋ公布的同種球蟲相應(yīng)序列同源性分別為９９．２％、９９．０％和９４．５％，與其他種球蟲序列的同源性為５５．３％～８２．１％。系統(tǒng)進化樹顯示兔球蟲ＩＴＳ序列形成單系群，該單系群又根據(jù)卵囊外殘體的有無分為２個亞群。研究結(jié)果表明ＩＴＳ序列種內(nèi)同源性高于種間同源性，可作為３種兔球蟲種間鑒定的分子標記。關(guān)鍵詞：腸艾美耳球蟲；黃艾美耳球蟲；大型艾美耳
3、球蟲；ｒＤＮＡＩＴＳ；序列分析；系統(tǒng)進化分析中圖分類號：Ｓ８５２．７２文獻標識碼：Ａ文章編號：１６７１－７２３６（２０１４）１２－００３０－０４兔球蟲病是由嚴重危害養(yǎng)兔業(yè)的艾美耳屬原蟲段序列統(tǒng)稱為ＩＴＳ序列，ＩＴＳ序列存在于高度重復(fù)寄生于兔肝臟和腸道，引起黃疸和腸道損傷出血甚的核糖體中，在生物進化過程中顯示種的特征，在不至死亡的一種寄生蟲病，給養(yǎng)兔業(yè)造成了巨大的經(jīng)同種間有不同程度的差異，種內(nèi)又具有高度保守性，濟損失（Ｐａｋａｎｄｌ，２００９；馬永華等，２００９）。目前公認被廣泛用于物種的分類鑒定方面（牛慶麗等，２００８）。的兔球蟲有１１個種，分別是斯氏艾美耳球蟲
4、（Ｅｉｍ－本研究以兔場常見的兔腸艾美耳球蟲、黃艾美耳球ｅｒｉａｓｔｉｅｄａｉ）、穿孔艾美耳球蟲（Ｅｉｍｅｒｉａｐｅｒ－蟲和大型艾美耳球蟲卵囊（廣西分離株）為研究對ｆｏｒａｎｓ）、大型艾美耳球蟲（Ｅｉｍｅｒｉａｍａｇｎａ）、中型艾象，進行ＩＴＳ序列測定及系統(tǒng)進化分析，為豐富兔美耳球蟲（Ｅｉｍｅｒｉａｍｅｄｉａ）、無殘艾美耳球蟲（Ｅｉｍ－球蟲分子鑒定方法奠定基礎(chǔ)。ｅｒｉａｉｒｒｅｓｉｄｕａ）、小型艾美耳球蟲（Ｅｉｍｅｒｉａｅｘ－１材料與方法ｉｇｕａ）、梨型艾美耳球蟲（Ｅｉｍｅｒｉａｐｉｒｉｆｏｒｍｉｓ）、腸艾１．１蟲種腸艾美耳球蟲廣西玉林株（Ｅｉｍｅｒｉａ美耳球蟲（
5、Ｅｉｍｅｒｉａｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、維氏艾美耳球蟲ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓＧＸＹＬ）、黃艾美耳球蟲廣西玉林株（Ｅｉｍｅｒｉａｖｅｊｄｏｖｓｋｙｉ）、黃艾美耳球蟲（Ｅｉｍｅｒｉａｆｌｓ－（ＥｉｍｅｒｉａｆｌａｖｅｓｃｅｎｓＧＸＹＬ）和大型艾美耳球蟲廣ｖｅｓｃｅｎｓ）和盲腸艾美耳球蟲（Ｅｉｍｅｒｉａｃｏｅｃｉｃｏｌａ）（閆西玉林株（ＥｉｍｅｒｉａｍａｇｎａＧＸＹＬ）均由佛山正典生文朝等，２０１０）。物技術(shù)有限公司提供。長期以來，球蟲的分類和鑒別主要依賴于卵囊１．２主要試劑ＤＮＡ提取試劑盒ＷｉｚａｒｄＳＶＧｅ－形態(tài)、致病性、寄生部位、腸道病變特征等指標（薛方ｎｏ
6、ｍｉｃＤＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ、ｐＧＥＭ－ＴＥａｓｙ載民，２００７），由于該病病原種類多，卵囊之間相似度體試劑盒、ＪＭ１０９感受態(tài)細胞均購自Ｐｒｏｍｅｇａ公高，極大的限制了對該病的準確鑒定。隨著現(xiàn)代分司；蛋白酶Ｋ購自Ｍｅｒｃｋ公司；ＥｘＴａｑＤＮＡ聚合子生物學(xué)及分子遺傳學(xué)的發(fā)展，研究者開始從分子酶、ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ、ＤＮＡ膠回收試劑盒均購生物學(xué)角度開展對該病的鑒別和診斷。內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔自寶生物工程（大連）有限公司。區(qū)（ＩＴＳ）是核糖體ＤＮＡ中介于１８Ｓ和２８Ｓ之間的１．３引物設(shè)計與合成參考Ｙａｎ等（２０１３）報道的間隔區(qū)，包括ＩＴＳ－
7、１、５．８Ｓ、ＩＴＳ－２序列，通常將這３擴增兔艾美耳球蟲ＩＴＳ序列的引物，引物序列為：上游引物ＥＩＴＳＦ：５′－ＧＧＡＴＧＣＡＡＡＡＣＴＣＧＴＡＡ－收稿日期：２０１４－０８－０４作者簡介：許家園（１９８８－），男，安徽人，碩士生，研究方向：獸醫(yī)ＣＡＣＧ－３′；下游引物ＥＩＴＳＲ：５′－ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡ－寄生蟲學(xué)。ＡＴＡＡＴＡＴＧＣＴ－３′，預(yù)期擴增片段大小為１２００ｂｐ。通信作者：林瑞慶（１９７３－），男，廣東人，副研究員，從事寄生蟲引物由華大基因公司合成。分子生物學(xué)研究。Ｔｅｌ：０２０－８５２８５９５４；Ｅ－ｍａｉｌ：ｒｑｌｉｎ＠ｓｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ１
8、．４球蟲卵囊ＤＮＡ提取用
