ezrin蛋白在糖尿病腎病鼠腎小球的表達及活性維生素d對其的影響

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1、Ezrin蛋白在糖尿病腎病鼠腎小球的表達及活性維生素D對其的影響：楊媛媛，鄒敏書余健聶國明羅莉漫徐洪濤趙林雙何威遜【摘要】目的：觀察Ezrin蛋白在糖尿病腎病(DN)大鼠腎小球的表達以及活性維生素D[1,25(OH)2D3]對其表達的影響。方法:)外側的終末分化細胞，構成腎小球濾過膜上機械屏障和電荷屏障的重要組成部分，其緊貼于腎小球基底膜(GBM)外側。因此，PC損傷、脫落是蛋白尿發(fā)生的病理基礎之一。近年來，PC內部結構的特殊蛋白成為研究的熱點。podocalyxin(PCX)、鈉氫交換調節(jié)因子2(NHERF2)、Ezrin分布于PC足突頂部，三者構成PCX/NHERF2/Ezri

2、n復合體參與了PC生理和病理的發(fā)生機制，其中PCX是維持負電荷屏障和保持足細胞形態(tài)的重要分子，它通過NHERF2/Erzin與肌動蛋白骨架αactinin4連接，維持PC結構穩(wěn)定[1]。Ezrin參與PC形態(tài)的維持、運動、黏附，并與PC生存有關。活性維生素D[1,25(OH)2D3]是臨床上常用的藥物，其可減少PC脫落，多途徑保護腎臟[2]。而其對Ezrin蛋白表達的影響作用不明。本文在DN模型鼠上觀察1,25(OH)2D3對Ezrin表達及PC排泄的影響，探討對其腎保護作用的機制?！　?材料與方法　　1.1糖尿病腎病大鼠的建立及分組　　健康雄性大鼠模型制備成功，繼續(xù)喂養(yǎng)，3

3、周后用雙縮脲法測定尿蛋白定量≥30mg/24h時，確認DN模型制備成功，將20只誘導成功的DN大鼠隨機分兩組：(1)DN組(n=10);(2)1,25(OH)2D3組(n=10)，埋植滲透性微量泵按0.03ng/g·d-1皮下給予1,25(OH)2D3[3]，連用8周。對照組(n=10)及DN組皮下給予等體積的蒸餾水。給予1,25(OH)2D38周抽血查餐后2h血糖(Glu)、血清肌酐(Scr)，代謝籠收集24h尿液，檢測24h尿蛋白(24hUP)及尿液足細胞(UPC);然后處死大鼠，取出雙腎，計算雙腎與體重之比，后腎小球免疫組化及免疫熒光染色。　　1.224hUP、UPC檢測

4、　　24hUP用考馬斯亮藍比色法測定。UPC檢測按鄒敏書等報道[4]的方法進行，以間接免疫熒光方法檢測腎小球足細胞特異性核心蛋白arkers公司，F(xiàn)ITC標記山羊抗小鼠二抗購自中山公司。　　1.3免疫組化檢測腎小球足細胞數(shù)量　　3μm厚的腎組織切片常規(guī)處理，PAS染色，在普通光學顯微鏡下觀察腎組織的病理變化。腎組織石蠟切片，微波抗原修復，小鼠抗Ezrin單克隆抗體(1∶50稀釋，福建邁新生物技術開發(fā)公司)，4℃孵育過夜，PBS洗滌，F(xiàn)ITC標記的羊抗小鼠IgG抗體，室溫孵育40min，PBS洗滌，封片，以PBS代替一抗為陰性對照。結果采用熒光顯微鏡(上海宙山精密光學儀器有限化司)觀察

5、。利用LaserPix4.0分析軟件，在每一例切片上隨機分別測量10個腎小球面積和每個腎小球內Ezrin陽性區(qū)域所占的面積，計算出每個腎小球內Ezrin陽性區(qū)域所占腎小球面積的比值，取其平均值。　　1.5統(tǒng)計學處理　　所有數(shù)據(jù)用(±s)表示，用SPSS11.0統(tǒng)計軟件完成，先進行方差齊性檢驗，方差齊時，多組比較用onean等級相關分析法，P<0.05具有統(tǒng)計學意義?！　?組大鼠腎球Ezrin的熒光分布及蛋白(Ezrin，Radixin，Moesin)家族的一員，為細胞內蛋白，通過氨基端與細胞膜相連，羧基端與肌動蛋白細胞骨架相連，成為膜細胞骨架的連接子。Exrin作為PC的標

6、志蛋白之一，其一端與PC頂膜區(qū)表面覆蓋一層負電荷的涎粘蛋白PCX及NHERF2相連，另一端與肌動蛋白相連，對維持負電荷和保持PC形態(tài)起重要作用。OstalskaNoRNA表達與蛋白尿與肌酐清除率相關;單用抗TNFα或TGFβ抗體可部分恢復Exrin的表達，2種抗體聯(lián)用可完全恢復Exrin的表達。本文結果表明，Ezrin表達與腎小球PC數(shù)目呈正相關，與尿蛋白及尿PC排泄呈負相關。表明Ezrin正常表達對防止PC脫落，維持腎小球PC數(shù)目，減輕蛋白尿起重要作用。PC損傷脫落，腎小球PC數(shù)量減少，不僅可引起蛋白尿，且有報道，尿液中脫落PC數(shù)量較尿蛋白更加敏感地反映進展性腎小球損傷[8

7、]?！　?,25(OH)2D3是臨床中常用的藥物，對腎臟的保護作用初現(xiàn)端倪:減少PC丟失及肥大;通過抑制腎素生成，下調腎素血管緊張素系統(tǒng)(RAS)系統(tǒng);降低慢性腎疾病(CHD)蛋白尿;降低纖維細胞因子TGFβ的生成[9]。但對PC保護作用機制尚不明確。Kuhlmann[3]報道1,25(OH)2D3可減少腎大部分切除鼠PC肥大及丟失，進而減輕蛋白尿及腎小球硬化。SchSocNephrol,2002,13(12):30053015.　　2鄒敏書,余