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《電針百會(huì)、神庭穴對(duì)缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。
1、電針百會(huì)、神庭穴對(duì)缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響 研究[1-3]表明針刺百會(huì)、神庭對(duì)改善腦卒中后認(rèn)知功能障礙(poststrokecognitiveimpairment,PSCI)有效.為探討針刺治療PSCI的機(jī)制,我們用Morris水迷宮系統(tǒng)和TUNEL檢測(cè)法觀察電針百會(huì)、神庭穴對(duì)缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶行為的影響. 1材料與方法 1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性健康成年清潔級(jí)SD大鼠30只,體質(zhì)量(275±25)g,福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,許可證號(hào):SYXK(閩)2005-004. 1.2材料28號(hào)0.5寸華佗牌不銹鋼毫針、華佗牌
2、SDZ-Ⅱ電針儀(北京瑞康眾成科技有限公司);Morris水迷宮(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所);TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所). 1.3大鼠分組隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組、模型組、電針組,每組各10只. 1.4模型制備手術(shù)組行左側(cè)大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)手術(shù),制備腦缺血再灌注動(dòng)物模型. 具體方法:10%水合氯醛(3ml/kg)腹腔麻醉成功后,在無菌狀態(tài)下,切開頸部皮膚,鈍性分離左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(I-CA),結(jié)扎ECA及CCA近心端,遠(yuǎn)心端穿線備用. 在CCA近分叉處剪一小口,插入魚
3、線進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈,至感覺有少許阻力(ECA與ICA分叉處約18~22mm).然后固定好魚線,尾端留在皮膚外以備抽線,順序縫合好肌肉皮膚,2h后抽線實(shí)現(xiàn)再灌注.實(shí)驗(yàn)過程和動(dòng)物蘇醒期間,注意保溫.假手術(shù)組只分離動(dòng)脈,不結(jié)扎、插線.動(dòng)物蘇醒后通過Longa法進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分,以判斷造模是否成功,不合格的大鼠剔除.以大鼠清醒后爬行時(shí)右轉(zhuǎn)圈、提尾時(shí)右前肢內(nèi)收屈曲為入選標(biāo)準(zhǔn). 1.5干預(yù)措施電針組取神庭、百會(huì),穴位定位參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[4].應(yīng)用SDZ-II電針儀,電壓6V,以針體輕輕抖動(dòng)為度,疏密波,頻率1~20Hz,每次30min,每日1次.手術(shù)后2
4、4h開始治療,共14d.模型組與假手術(shù)組于手術(shù)后回籠飼養(yǎng),只給予同等條件抓取,不做任何治療. 1.6大鼠行為學(xué)觀察1.6.1神經(jīng)功能評(píng)分造模2h按Longa法進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分.0分:無神經(jīng)損傷癥狀;1分:不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪;2分:外側(cè)(右)轉(zhuǎn)圈;3分:向?qū)?cè)傾倒;4分:不能自發(fā)行走,意識(shí)喪失.分值越高,損傷越嚴(yán)重.造模后24h評(píng)分,以判斷造模是否成功.電針干預(yù)后,用于評(píng)價(jià)電針干預(yù)效果. 1.6.2Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)水迷宮的水池為120cm50cm30cm,水溫(26±2)℃.池壁上4個(gè)等距離點(diǎn)將水池分為4個(gè)象限,池壁外
5、標(biāo)4個(gè)入水點(diǎn),任選1個(gè)象限在其中央放置平臺(tái),大小為6cm28cm,平臺(tái)沒于水面下2cm,水池周圍參照物保持不變.2組大鼠在電針干預(yù)后第7天進(jìn)行訓(xùn)練,第8天正式開始,持續(xù)進(jìn)行6d.Morris水迷宮包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)2個(gè)部分. 將受試大鼠按順時(shí)針方向依次由東北、東南、西南、西北4個(gè)象限入水點(diǎn)順序面向池壁放入水中. 如果大鼠在90s內(nèi)爬上平臺(tái),并停留3s以上,則認(rèn)為大鼠找到平臺(tái),此為逃避潛伏期.如果90s大鼠未能找到平臺(tái),則拖拽其尾部,將其引導(dǎo)到平臺(tái),熟悉10s,此時(shí)潛伏期按90s計(jì)算.每次訓(xùn)練間隔為5min,計(jì)算每一時(shí)段4個(gè)方向潛伏
6、期的平均數(shù)及搜索平臺(tái)所經(jīng)過的路程.歷時(shí)6d,每日1次.空間探索試驗(yàn)測(cè)試大鼠學(xué)會(huì)尋找平臺(tái)后,對(duì)平臺(tái)空間位置記憶的能力.定位航行試驗(yàn)結(jié)束后撤出平臺(tái),然后任選一相同入水點(diǎn)將大鼠放入水中,測(cè)其90s內(nèi)大鼠穿過原平臺(tái)區(qū)域的次數(shù). 1.7大鼠腦組織細(xì)胞凋亡TUNEL檢測(cè)制作石蠟切片,用二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化,0.85%NaCl浸洗,浸入4%多聚甲醛固定15min,PBS浸洗,在每片載玻片上加100μL的20μg/mL蛋白酶K覆蓋組織切片.室溫孵育10min,PBS浸洗5min,組織切片洗滌后固定,將樣本PBS浸洗,室溫放置5min,取出后加1
7、00μL平衡液放置10min平衡,加100μLTUNEL反應(yīng)混合液在標(biāo)本上,加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37℃孵育60min,浸入2SSC緩沖液中,室溫放置15min終止反應(yīng),PBS浸洗5min重復(fù)3次,加入50μLDAPⅠ,避光室溫下10min,浸入去離子水中,室溫放置5min,重復(fù)3次,用玻璃蓋玻片及抗熒光淬滅劑封片,并晾干,立即在激光共聚焦顯微鏡下分析樣片,用標(biāo)準(zhǔn)的熒光過濾裝置在530nm處觀察綠色熒光,在460nm處觀察藍(lán)色的DAPⅠ. 1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)用x±s和中位數(shù)表示,采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)
8、分析軟件處理,組間比較用t檢驗(yàn)、單因素方差分析、LSD法檢驗(yàn),不符合正態(tài)分布的用秩和檢驗(yàn),P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. 2
