蛋白酶活化受體1單克隆抗體的制備與鑒定

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1、蛋白酶活化受體1單克隆抗體的制備與鑒定：馬文靜，何韶衡，周艷春，陳玉珍，黃闐，方澤漫，陳霖霏【摘要】目的制備蛋白酶活化受體1(PAR1)單克隆抗體(mAb)。方法以PAR1特異性片段為免疫原(13肽)免疫BALB/c小鼠，運(yùn)用雜交瘤技術(shù)制備抗PAR1mAb。采用捕獲酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(captureELISA)鑒定mAb的Ig亞類；通過ELISA、Dotblot、免疫組化染色法、流式細(xì)胞儀分析、激光共聚焦顯微鏡技術(shù)鑒定mAb的特異性。結(jié)果獲得2株可穩(wěn)定分泌抗PAR1mAb的雜交瘤細(xì)胞，其亞型分別為IgM、IgG2b。免疫組化染色表明，mAb與人扁桃體

2、、結(jié)腸組織中的淋巴細(xì)胞、包皮組織中的成纖維細(xì)胞、肺組織中的巨噬細(xì)胞反應(yīng)呈陽性。流式細(xì)胞儀分析顯示，2株mAb與人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞胞漿內(nèi)及細(xì)胞膜上的PAR1均呈陽性反應(yīng)。激光共聚焦掃描顯微鏡觀察，熒光標(biāo)記的陽性反應(yīng)物在A549細(xì)胞胞漿內(nèi)及細(xì)胞膜上均可見。結(jié)論成功地制備出抗PAR1mAb，為進(jìn)一步研究炎癥性疾病提供有用的試劑?！娟P(guān)鍵詞】蛋白酶活化受體1；單克隆抗體；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)　　Productionandidentificationofmonoclonalantibodies　againstproteinaseactivatedreceptor

3、1　　ABSTRACT:ObjectiveToproduceandidentifyantiPAR1monoclonalantibodies.MethodsBALB/cmicemunizedinoacidpeptideofPAR1andhybridomacelllinesatechnology.ThespecificityofmAbselinkedimmunosorbentassay(ELISA),dotblot,immunohistochemicalstaining,floetry(FCM)andconfocallaserscanningmicros

4、copy(CLSM).ResultsTacelllinesthatsecretedmAbsagainstPAR1AbmunohistochemicalstainingrevealedthatthereactivitiesofmAbstothelymphocytecellsintonsilandcolontissues,tofibroblastcellsinforeskintissues,tomacrophagesinlungtissuesAbsreactedtoPAR1expressedbothonthemembranesurfaceandinthecyt

5、oplasmofA549cells.CLSMexaminationshoarkersembraneandinthecytoplasmofA549cells.ConclusionThemAbsagainstPAR1arepreparedsuccessfully,matorydiseases.　　KEYEM、HAT購自Gibco公司；胎牛血清購自Hyclone公司；PEGMerck公司；化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Pierce公司；PE標(biāo)記的大鼠抗小鼠IgM及PE標(biāo)記的大鼠抗小鼠IgG2b抗體購自SouthernBiotech公司?！　?.4雜交瘤細(xì)胞的建立免疫動(dòng)物：將1

6、g/L的PAR10.50mL與等體積的福氏完全佐劑混合并充分乳化后，皮下多點(diǎn)注射3只BALB/c小鼠。間隔3周進(jìn)行第2次免疫，改用福氏不完全佐劑，抗原量及注射途徑不變。3周后進(jìn)行第3次免疫，抗原量及注射途徑不變。融合前3d，經(jīng)尾靜脈注射0.20mL的抗原生理鹽水溶液加強(qiáng)免疫1次。細(xì)胞融合、雜交瘤細(xì)胞的篩選及克隆化，均按實(shí)驗(yàn)室常規(guī)進(jìn)行?！　?.5mAb效價(jià)及Ig亞類的鑒定①效價(jià)測(cè)定：方法參照文獻(xiàn)[1]。將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清按1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128稀釋后用間接ELISA法測(cè)定A450值，以與靶抗原發(fā)生反應(yīng)的mAb

7、的最大稀釋度即為其效價(jià)。②Ig亞類的鑒定：用captureELISA法鑒定抗PAR1mAb的Ig亞類。方法如下，分別用抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgM1∶1000稀釋后取50μL包被檢測(cè)板，室溫放置3h；PBST沖洗3次后用30g/LBSA100μL封閉4℃過夜；PBST沖洗3次加待測(cè)上清50μL，陽性對(duì)照分別加入鼠源50μL1∶1000稀釋的IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgM，陰性對(duì)照加50μLPBST，室溫90min；PBST沖洗3次加polyantimouseIg,室溫60min；PBST沖洗3次

8、顯色?！　?.6mAb的特異性鑒定