sox9基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其誘導(dǎo)大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞定向分化為骨骺干細(xì)胞

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1、Sox9基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其誘導(dǎo)大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞定向分化為骨骺干細(xì)胞：胡偉華,陳安民,郭風(fēng)勁,李鋒,黃暉,張偉凱【摘要】［目的］從永生化骨骺干細(xì)胞中克隆Sox9基因并構(gòu)建真核表達(dá)載體，并探討Sox9誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向骨骺干細(xì)胞分化的可能性。［方法］以RTPCR方法獲得Sox9全長(zhǎng)，插入pGEMTEasy克隆載體中，測(cè)序正確后與pEGFPIRES2表達(dá)載體酶切后連接，復(fù)合質(zhì)粒以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞，觀察轉(zhuǎn)染效率，Sox9和FGFR3的表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表型，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。［結(jié)果］成功的完成了Sox9的擴(kuò)增和表達(dá)載體的構(gòu)建,重組

2、載體轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞后能檢測(cè)到Sox9、FGFR3的表達(dá)，增殖活性與骨骺干細(xì)胞無(wú)異。［結(jié)論］成功構(gòu)建了Sox9真核表達(dá)載體，其能誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞分化為骨骺干細(xì)胞并具有其特性?！娟P(guān)鍵詞】骨骺干細(xì)胞；Sox9；骨髓基質(zhì)細(xì)胞；轉(zhuǎn)染Abstract：［Objective］ToconstructeukaryoticexpressionvectorcontainingSox9derivedfromimmortalizedprecartilaginousstemcellsandtoprobeitsinductiveeffectonmarroacellsdifferenti

3、atingintoprecartilaginousstemcells.［Method］Sox9arroacells.TheexpressionofSox9andFGFR-3munohistochemisty.IdentificationandproliferationinedbyfloetryandMTT.［Result］Sox9cloningandexpressionvectorconstructionarroacellsaftertransfection,ilartoprecartilaginousstemcells.［Conclusion］Sox9euk

4、aryoticexpressionvectorhasbeensuccessfullyestablished.Sox9caninducemarroacellstodifferentiateintoprecartilaginousstemcells.Keycells;Sox9;marroacells;transfection骨骺干細(xì)胞（precartilaginousstemcells,PSCs）是控制生長(zhǎng)期動(dòng)物肢體生長(zhǎng)、能定向分化的成體干細(xì)胞［1］。它作為組織工程的種子細(xì)胞，可用于軟骨與骨缺損的細(xì)胞替代治療［2］。PSCs第5代即開始分化，且取材困難，原代細(xì)胞培

5、養(yǎng)技術(shù)尚不能在體外獲得大量表型一致的PSCs［3］。將容易的骨髓基質(zhì)細(xì)胞（marroacells,MSCs）誘導(dǎo)分化至PSCs，有望解決此難題。而Sox9抑制骨骺細(xì)胞的終末期分化，延長(zhǎng)軟骨的成熟過(guò)程并抑制其凋亡。為此，筆者構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFPIRES2Sox9，并轉(zhuǎn)染MSCs，以期誘導(dǎo)分化為PSCs，為研究骨骺細(xì)胞分化機(jī)制及組織工程提供穩(wěn)定的細(xì)胞。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料及主要試劑永生化骨骺干細(xì)胞株、菌種E.coliDH5α由同濟(jì)醫(yī)院骨科實(shí)驗(yàn)室保存，DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清（Gibco），TrizolReagent（Toyobo），兔多克

6、隆抗體FGFR3/c15（SantaCruz），RTPCR試劑盒（Toyobo），BamHI、EcoRI、pGEMTEasy（Promega），pEGFPIRES2（Initrogen）,LipofectamineTM2000（Invitrogen）,Ⅱ型膠原及X型膠原抗體（Promega），一抗兔抗鼠CD44、CD45、CD34及二抗AlexaFluorgoatantirabitIgG(Sigma)。1.2引物設(shè)計(jì)根據(jù)GeneBank(NM012636)序列編碼區(qū)自行設(shè)計(jì)引物（分別含BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)），由上海英駿生物公司合成，上游序

7、列為：5'ATGGAAATCACGGAAGAGCGTC3，下游序列為：5'GTGCTGAAGGGCTACGACTGGA3。1.3方法1.3.1Sox9基因的RTPCR取第3代IPSCs約106數(shù)量級(jí)，按TrizolReagentKit說(shuō)明書操作，一步法提取總RNA，測(cè)濃度后取約2μg總RNA作為逆轉(zhuǎn)錄模板，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明合成cDNA第1鏈，PCR反應(yīng)：95℃預(yù)變性5min，94℃變性1min；62℃退火45s；72℃延伸50s；經(jīng)35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。取5μL反應(yīng)產(chǎn)物，以0.2%瓊脂糖凝膠電泳，初步鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物。1.3.2Sox

8、9克隆載體的構(gòu)建和測(cè)序經(jīng)PCRBios