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《鼠骨骺增殖區(qū)細(xì)胞的分離鑒定和克隆構(gòu)建pthrp基因真核表達(dá)載體》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、鼠骨骺增殖區(qū)細(xì)胞的分離鑒定和克隆構(gòu)建PTHrp基因真核表達(dá)載體作者黃仕龍 陳安民 郭風(fēng)勁 張衣北【關(guān)鍵詞】殖區(qū)軟骨細(xì)胞,摘要：［目的］分離、鑒定大鼠骨骺生長板增殖區(qū)軟骨細(xì)胞，克隆甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白（PTHrp）基因并構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFPIRES2PTHrp。［方法］Percoll不連續(xù)密度梯度離心法分離生長板增殖區(qū)軟骨細(xì)胞，用X型膠原抗體和電鏡鑒定，提取總RNA，RTPCR方法獲得PTHrp基因的全長cDNA，插入pCR21TA克隆載體中進(jìn)行序列測定，測序正確后將其亞克隆至表達(dá)載體pEGFPIRES2。［
2、結(jié)果］分離出增殖區(qū)軟骨細(xì)胞，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析和DNA序列測定證實(shí)目的基因已插入重組質(zhì)粒。［結(jié)論］準(zhǔn)確分離增殖區(qū)軟骨細(xì)胞并成功構(gòu)建了PTHrp基因的真核表達(dá)載體，為進(jìn)一步揭示PTHrp的生物學(xué)功能及其在在軟骨細(xì)胞的分化和骨骼形態(tài)發(fā)生中的作用奠定了基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞：PTHrp基因；質(zhì)粒；殖區(qū)軟骨細(xì)胞；表達(dá)載體 Identificationofepiphysealproliferatingzonecellsandconstructionofeukaryoticexpressionvectorcontaini
3、ngPTHrpgene Abstract：［Objective］Toseparatesproliferatingzonecellsfromthegroonerelatedpeptidegene(PTHrp)andconstructitseukaryoticexpressionvector［Method］AftercentrifugationthroughadiscontinuousPercollgradient,thethirdandfourthfractionscellpopulationsofgroicro
4、scopeimageThetotalRNAcellsafteridentificationandthefulllengtheDNAencodingPTHrpgeneethodandinsertedintopCR21TAcloningvectorAfterthesequencinged,thegenegroedigestionanalysisandsequencingshoidcontainingPTHrpgeneaybeapromisingforstudyingthebiologicalfunctionofthe
5、PTHrpgeneanditsroleinchondrocytedifferentiationandboneformation Keyid;GroHI、EcoRl、TaqDNA合成酶，購自MBIFermentas公司，T4DNA連接酶購自Promega公司，兔抗鼠anticollagentypeX購自Calbiochem公司，PCRcleanupkit、NDAExtractionKit、PlasmidlsolationKit購自上海華舜公司，SP9000免疫組化試劑盒、ZLI9032濃縮型DAB試劑盒購自北京中
6、杉金橋公司?！ ?12引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GeneBank(NM012636)序列編碼區(qū)自行設(shè)計(jì)上下游引物，由上海生工工程公司合成，上游序列為：5′CGGAATTCTGGAGGCGCTGATTCCTACA3′，下游序列為：5′CGGGATCCAACGTGTCCTTGGAAGATCT3′。 12方法 121骨骺生長板增殖區(qū)軟骨細(xì)胞的取材參考靳小兵〔1〕，BarbaraDBoyan等〔2〕的方法并做適當(dāng)改良。無菌分離新生SD大鼠股骨和脛骨，去除軟組織，銳性分離骨骺與骨干之間膨大、半透明組織置DMEM／F12培養(yǎng)基中，
7、充分剪碎37℃孵育過夜。根據(jù)Ju¨rgenEM／F12洗滌，001％膠原酶P37℃溫和振蕩消化過夜，繼以01％膠原酶P37℃處理4h以充分釋放細(xì)胞。40目篩網(wǎng)過濾、洗滌后以含001％DNA酶I的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，小心移至預(yù)先配置的不連續(xù)percoll密度梯度液頂層，400g離心1h，取第4層細(xì)胞(密度約為1053g／ml)觀察(圖1)、計(jì)數(shù)后接種于含10％FBS、50μg／mlVitC的DMEM／F12培養(yǎng)基中，5％CO2，100％濕度，37℃培養(yǎng)24h后換液，以后每72h換液1次，細(xì)胞融合至75％～80％傳代。取
8、傳第4代細(xì)胞鑒定(圖2)〔3〕?！ ?22增殖區(qū)軟骨細(xì)胞的鑒定 取第4代細(xì)胞，以104／ml的密度接種于24孔板，培養(yǎng)3~5d，細(xì)胞爬片后按SP試劑盒的方法固定、漂洗、破膜，anticollagentypeX孵育，DAB顯色，常規(guī)脫水、透明、封片后觀察(圖3)。取生長良好的第4代細(xì)胞，常規(guī)方法制備透射電鏡標(biāo)本(圖4)?！ ?23PTHrp基因的克隆 取第4代軟骨細(xì)胞約
