mda7基因的腺病毒載體構(gòu)建及對腫瘤細(xì)胞凋亡的

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1、MDA7基因的腺病毒載體構(gòu)建及對腫瘤細(xì)胞凋亡的【摘要】構(gòu)建一種端粒酶啟動子調(diào)控目的基因MDA7/hIL24表達(dá)的復(fù)制缺陷型腺病毒，并初步探索其抗腫瘤活性。方法：通過基因操作技術(shù)將啟動子（hTERTp）+目的基因(MDA7)插入到5型腺病毒E1A區(qū)域，構(gòu)建復(fù)制缺陷型腺病毒AdTPmda7；同時構(gòu)建對照病毒AdTPEGFP。TCID50法測定病毒滴度。應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法檢測MDA7在腫瘤細(xì)胞株中的表達(dá)狀態(tài)；通過結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)檢測兩種病毒對腫瘤細(xì)胞的殺傷差異。結(jié)果：成功構(gòu)建攜帶目的基因的腺病毒載體，PCR鑒

2、定正確；蛋白質(zhì)印跡結(jié)果表明MDA7選擇性地在多種腫瘤細(xì)胞株中表達(dá),誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，如A549，SGC7901等，在以相同MOI值感染原代成纖維細(xì)胞時，原代細(xì)胞中沒有檢測到MDA7表達(dá)；結(jié)晶紫染色試驗(yàn)結(jié)果表明AdTPmda7對腫瘤細(xì)胞株的殺傷能力明顯高于對照病毒AdTPEGFP。結(jié)論：成功構(gòu)建復(fù)制缺陷型腺病毒AdTPmda7，并證實(shí)MDA7蛋白在腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞株發(fā)生凋亡?！娟P(guān)鍵詞】復(fù)制缺陷型腺病毒端粒酶啟動子腫瘤基因治療［Abstract］Objective:Todevelopa

3、proliferationdeficientadenovirusforgenetherapyinoterorcells.Methods：Atumorspecificproliferationdifficientadenovirusvectorployingthehumantelomerasereversetranscriptase(hTERT)promotertodrivetheexpressionofadenovirusmediatedtargetgene;atthesametimeAdSuTPEG

4、FPethod.TheexpressionofMDA7orcelllinesMHCC,SGC7901,A549,andsoon,andinducedapoptosis，arylungfibroblastda7da7,ultaneouslyverifiedthattheoverexpressionofMDA7intumorcellsinducedtumorcellapoptosis,andsignificantfortargetedtumorgenetherapy.［Keyerasereversetransc

5、riptase（hTERT）promoter；tumortargetedgenetherapy黑色素瘤分化相關(guān)基因7（MDA7），是1995年由哥倫比亞大學(xué)Jiang等［1］通過差減雜交方法從干擾素和瑞香素誘導(dǎo)的終末分化的人黑色素瘤細(xì)胞HO1中分離獲得的一種新基因，具有腫瘤抑制因子和細(xì)胞因子活性。2001年根據(jù)其基因定位和分子結(jié)構(gòu)將其歸為IL10家族，重命名為IL24［2］。研究發(fā)現(xiàn)MDA7蛋白對多種人腫瘤細(xì)胞（包括肺癌、前列腺癌、乳腺癌、宮頸癌、骨肉瘤、腸癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤等）的生長均有抑制作用，并

6、可抑制血管生成、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，對正常細(xì)胞沒有影響［3］。增殖性腺病毒在腫瘤研究方面具有很好的理論優(yōu)勢，但是人體內(nèi)環(huán)境是一個極其復(fù)雜神秘的整體，考慮到安全性，我們選擇構(gòu)建復(fù)制缺陷型腺病毒。端粒酶陽性表達(dá)是人類實(shí)體瘤的重要特性，在85％以上的腫瘤細(xì)胞中端粒酶表達(dá)陽性，而在絕大多數(shù)正常體細(xì)胞中為陰性［3］。利用這一特性，我們設(shè)計(jì)構(gòu)建一種復(fù)制缺陷型腺病毒AdTPmda7，用人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶啟動子（hTERTp）調(diào)控MDA7蛋白表達(dá)，更好地實(shí)現(xiàn)MDA7對腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，為腫瘤的基因治療和臨床研究提供依據(jù)。1

7、材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料人肺腺癌細(xì)胞株（A549）、人胃癌細(xì)胞株（SGC7901）購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。人原代肺成纖維細(xì)胞由本室培養(yǎng)保存。胎牛血清、DMEM、RPMI1640購自美國GibcoBRL公司。pUC19,pDC312,DH5α、攜帶EGFP報(bào)告基因的腺病毒載體質(zhì)粒pAdTPEGFP、含有5型腺病毒右臂基因組且E1/E3區(qū)缺失的腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGE3由本實(shí)驗(yàn)室保存。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司。限制性內(nèi)切酶、T4連接酶系TaKaRa大連生物

8、技術(shù)有限公司產(chǎn)品?？筂DA7抗體購自美國RD公司。目的基因（MDA7）引物（P1：3′CGGCTAGCACCATGAATTTTCAACAGA5′,P2：5′GCGTCGACTTATCAGAGCTTGTAGAAT3′）,EGFP基因引物(P3：3′GCTCTAGAGAATTCACCATGGTGAGCAAGGGC5′,P4：5′CGGGATCCGTCGACTTATTACC