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1、成人成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)關(guān)鍵字：成骨細(xì)胞 堿性磷酸酶 骨鈣素 膠原 摘 要：目的：改良成人成骨細(xì)胞消化培養(yǎng)方法，以滿足在細(xì)胞學(xué)水平進(jìn)行骨代謝性疾病研究的需要。方法：取無菌骨碎片，先用胰蛋白酶消化多次，以去除血細(xì)胞和成纖維細(xì)胞；骨片經(jīng)短期培養(yǎng)后，再次使用胰蛋白酶消化，得到大量純凈成骨細(xì)胞。細(xì)胞長至匯合后生成黑色結(jié)節(jié)。分別采用NPP底物法、125I標(biāo)記放射免疫(RIA)法和Ⅰ、Ⅲ型膠原順序沉淀抽提、SDS－PAGE還原電泳法測(cè)定細(xì)胞上清中成骨細(xì)胞主要特征性分泌物：大量堿性磷酸酶(AKP)、骨鈣素(O)和Ⅰ型膠原?！?/p>
2、結(jié)果：黑色結(jié)節(jié)經(jīng)四環(huán)素染色，熒光顯微鏡下觀察為骨結(jié)節(jié)特征性的金黃色。成骨細(xì)胞上清中AKP分泌量為(2.76±0.56)IU/ml、O分泌量為(1.875±0.549)ng/ml，明顯高于成纖維細(xì)胞(P＜0.01)?？蓹z測(cè)到Ⅰ型膠原而無Ⅲ型膠原。結(jié)論：此改良方法可以在短期內(nèi)得到大量性狀穩(wěn)定成骨細(xì)胞，同時(shí)避免成纖維細(xì)胞混入?！ ￡P(guān)鍵詞：成骨細(xì)胞 堿性磷酸酶 骨鈣素 膠原 成骨細(xì)胞特征性表型為分泌骨鈣素(O)、大量堿性磷酸酶(AKP)和Ⅰ型膠原’而無Ⅲ型膠原分泌［1］。我們采用改良骨組織消化培養(yǎng)方法，將骨片經(jīng)短期
3、培養(yǎng)后’再用胰蛋白酶消化’加快骨細(xì)胞的釋放。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察及特征性分泌物檢測(cè)證實(shí)’獲得成骨細(xì)胞數(shù)量多，并與纖維細(xì)胞有明顯區(qū)別?！ 〔牧吓c方法 一、液體的配制 0.25%胰蛋白酶用trypsin(1:250DIFCO’Detroit’Michigan)溶解于d-Hank’s液，抽濾滅菌。培養(yǎng)液使用DMEM+HAMF121∶1混合液(GibcoBRL’GrandIsland’NY)’加20%滅活新生牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml。低血清培養(yǎng)液為5%滅活新生牛血清，其余同培養(yǎng)液。使用25cm
4、2培養(yǎng)瓶(NUNCLON’Denmark)?！ 《?、骨組織片消化 取骨科手術(shù)中獲得的無菌骨碎片’徹底去除骨膜及軟組織；用無菌Hank′s液沖洗3次’剪碎至體積小于1mm3；Hank′s液多次沖洗至骨片發(fā)白’放入錐形瓶內(nèi)’加入0.25%胰蛋白酶(骨碎片10倍體積)’37℃水浴中消化(30min×5)’去掉上清。剩余骨片浸泡于培養(yǎng)液中’置37℃CO2培養(yǎng)箱內(nèi)2～3d后’吸出培液’加入0.25%胰蛋白酶’37℃水浴中消化30min’上清液經(jīng)尼龍網(wǎng)過濾后’離心10min(1000r/min)’去掉上清液’沉淀物用培
5、養(yǎng)液打勻’接種于25cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)’重復(fù)3次’直至離心后無沉淀物為止。 將消化后的骨片浸泡于培養(yǎng)液中’2～3d后’重復(fù)上述胰蛋白酶消化步驟’仍有細(xì)胞釋放’根據(jù)所需細(xì)胞量’可重復(fù)數(shù)次。接種后培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)液較渾濁’10h后即有貼壁細(xì)胞’72h后’細(xì)胞完全貼壁’可沖洗、換液。此后隔日換液。取第二、三代細(xì)胞，消化后，以1×105/ml濃度接種于培養(yǎng)瓶中，每瓶4ml’5d后換低血清培養(yǎng)液6ml，24h后收集上清液，分裝于5個(gè)離心管內(nèi)，-18℃保存’用于檢測(cè)。 三、成骨細(xì)胞特征性鑒定 以皮膚成纖維細(xì)胞作為對(duì)照，鑒定
6、實(shí)驗(yàn)所得成骨細(xì)胞?！ ?.形態(tài)學(xué)觀察:除常規(guī)形態(tài)學(xué)觀察外，采用趨骨性熒光素標(biāo)記細(xì)胞培養(yǎng)生成結(jié)節(jié)。細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)加入四環(huán)素’使終濃度為50μg/ml’培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1h’換新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)1h，經(jīng)Hank′s液沖洗3次’乙醇梯度脫水’固定’Olympus-Vanox-T顯微鏡落射熒光觀察?！ ?.成骨細(xì)胞上清液AKP檢測(cè):采用磷酸對(duì)硝基苯酯二鈉鹽(p-Nitrophenylphosphatedisodiumsalt’NPP’上海麗珠東風(fēng)公司)比色法［2］’無色p-NPP與AKP在37℃水浴中反應(yīng)生成黃色對(duì)硝基苯p-N
7、itrophenol’經(jīng)405nm波長比色’測(cè)得OD值’換算成國際單位?！ ?.成骨細(xì)胞上清液中骨鈣素檢測(cè):采用BGP放免試劑盒(北京東亞免疫技術(shù)研究所)檢測(cè)［3］。根據(jù)放射免疫競爭結(jié)合原理，125I標(biāo)記O和樣品所含O與O抗體競爭結(jié)合，使用分離劑使結(jié)合抗體沉淀，4℃離心后，γ計(jì)數(shù)器測(cè)定沉淀物cpm數(shù)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品曲線得到樣品O含量?！ ?.成骨細(xì)胞上清液中膠原抽提及檢測(cè):采用中性、酸性Nacl溶液順序沉淀抽提［4］，SDS-PAGE垂直板還原電泳法［2］。配制7.5%-0.2%bis聚丙烯酰胺凝膠板固定于垂直板
8、電泳槽［5］。電泳液為0.05MTris、0.38M甘氨酸、0.01%SDS(pH=8.8)；樣品液為0.125MTris、15%甘油、2M尿素、2%SDS、0.001%溴酚蘭；染色液為0.25%考馬斯亮藍(lán)R250、25%異丙醇和10%HAC；脫色液為5%異丙醇和8%HAC。樣品解凍后’放55℃水浴中變性1h’加入樣品緩沖液50μl’每個(gè)樣品點(diǎn)2孔’每孔加樣20μl’另加Ⅰ、Ⅲ型膠原標(biāo)準(zhǔn)品’50mA
