肺腺癌與肺鱗癌胸腔積液差異蛋白質組學分析

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1、肺腺癌與肺鱗癌胸腔積液差異蛋白質組學分析：施孟如，林全，鄭易，王良興【摘要】目的：建立肺腺癌與肺鱗癌胸腔積液的雙向電泳圖譜，分析二者蛋白質表達的差異和特點。方法：選取肺腺癌伴胸腔積液標本12例，肺鱗癌伴胸腔積液標本8例，以固相pH梯度等電聚焦為第一向，垂直板SDS-PAGE為第二向分離胸水蛋白質，銀染顯色，掃描儀獲取凝膠圖像并對其進行分析。結果：同組實驗重復3次，其中肺腺癌胸腔積液蛋白質點平均(376±17)個，同組匹配率為88.3%;肺鱗癌胸腔積液蛋白質點平均(383±21)個，同組匹配率為8

2、6%。經(jīng)軟件分析，肺腺癌胸腔積液中表達增高2倍的差異蛋白點29個，降低50%的蛋白質點50個。有3個點僅在肺腺癌胸腔積液表達，5個點僅在肺鱗癌胸腔積液中表達。結論：肺腺癌與肺鱗癌胸腔積液差異蛋白可能是不同病理類型的肺癌細胞分泌的特殊蛋白或特異性蛋白標志物?！娟P鍵詞】胸腔積液;肺腺癌;肺鱗癌;雙向電泳;蛋白質組肺癌是引起胸腔積液最常見的原因之一[1]。目前臨床上主要采用胸水脫落細胞以及實驗室生化檢查等方法來鑒別胸腔積液的原因。利用雙向電泳分離蛋白質，能夠從大量蛋白質中直接篩選出特異蛋白質，為很多疾

3、病的發(fā)病機制研究和臨床診斷提供依據(jù)[2-3]。本研究利用雙向凝膠電泳技術分析肺腺癌與肺鱗癌胸水的蛋白質組，試圖為尋找不同類型肺癌相關蛋白或特異性蛋白標志物打下基礎，為腫瘤的診斷、分型、藥物研究帶來新的思路和途徑?！　?材料和方法　　1.1主要試劑和儀器丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、超純尿素(ultraurea)、硫脲(thiourea)、3-[3-(膽酰胺基丙基)二甲氨基]丙磺酸鹽(CHAPS)、四甲基乙二胺(TEMED)、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰氨、固相pH干膠條(17cm，pH4～7)，Bi

4、o-lytepH3～10，2-Dcleanup試劑盒等(Bio-Rad公司);蛋白酶抑制劑混合液protaseinhibitorcocktail(Sigma公司)，所有溶液均用MilliQ水配制?！　ROTEANIEFCELL等電聚焦儀，PROTEANⅡXi垂直板電泳儀及其附件，GS-800掃描成像系統(tǒng)，PDQuest凝膠圖像分析軟件(Bio-Rad公司)，UV2800紫外可見分光光度計(上海尤尼柯公司)?！　?.2標本溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院2007年11月-2008年6月門診及住院患者20例

5、，年齡32～78歲。肺腺癌伴胸腔積液12例，肺鱗癌伴胸腔積液8例，所有病例均經(jīng)支氣管鏡組織活檢和刷取涂片細胞學檢查所確診?！　?.3實驗方法　　1.3.1標本制備：每例胸腔積液標本各取10mL，同組標本混合后4℃，4000r/min離心10min，取上清液。所有標本按照1:4(V/V)比例加入10%TCA-丙酮溶液，混勻后于-20℃放置過夜，4℃，14000r/min，離心30min，棄上清，沉淀用預冷的丙酮，4℃，14000×g，離心5min，洗2次，棄上清，沉淀用裂解液(8mol/L尿素，4

6、%CHAPS，50mmol/LDTT，0.2%Bio-Lyte)重懸后用Bradford法[4]測蛋白質濃度，-80℃冰箱保存?zhèn)溆??！　?.3.2雙向凝膠電泳：參考文獻[5]方法，根據(jù)樣品情況適當改進。第一向——固相pH梯度等電聚焦凝膠電泳，采用低電壓膠內泡脹法，將200μg蛋白樣品與上樣緩沖液(8mol/L尿素，2%CHAPS，50mmol/LDTT，0.2%Bio-Lyte，0.001%溴酚藍)共300μL混合后加入聚焦盤中，選用pH4～7線性17cm膠條，IPG膠條膠面朝下放入水化液，加蓋

7、3mL礦物油。聚焦參數(shù)見表1。等電聚焦后的IPG膠條依次在含1%DTT和2.5%碘乙酰胺的平衡緩沖液(6mol/L尿素，2%SDS，50mmol/LTris-HClpH8.8，20%甘油)中各平衡15min，轉移至8%～16%線性梯度SDS-聚丙烯酰胺凝膠的上端，瓊脂糖封頂。　　第二向——SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)：以恒流10mA/gel電泳15min，再加大電流至30mA/gel直至溴酚藍達到膠的底端。按照文獻[6]方法進行高靈敏度的銀染?！　?.3.3凝膠圖像的采集和分析

8、：凝膠用GS-800圖像掃描儀透射掃描，分辨率為：63.5×63.5microns。圖像配比分析采用PDQuest7.4.0進行詳細分析、比較蛋白質點差異?！　?結果　　2.1肺腺癌胸腔積液組和肺鱗癌胸腔積液蛋白質雙向電泳圖譜的建立在相同條件下，同組實驗重復3次。用PDQuest軟件分析，其中肺腺癌胸腔積液蛋白質點平均(376±17)個，同組匹配率為88.3%;肺鱗癌胸腔積液蛋白質點平均(383±21)個，同組匹配率為86%。蛋白質雙向電泳圖譜(見圖1)，從左到右等電點增加，從下往上分子質量增加