復方大果木姜子乳膏體外抗hsv1病毒的實驗研究

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1、復方大果木姜子乳膏體外抗HSV1病毒的實驗研究【摘要】目的通過對復方大果木姜子軟膏Ⅰ號、Ⅱ號、Ⅲ號3個制劑處方水提、醇提物體外抗HSV1病毒作用的研究，優(yōu)選出一個最佳組方提取工藝，為進一步將其開發(fā)成一種安全有效的治療單純性皰疹病毒的中藥新藥提供依據(jù)。方法通過細胞培養(yǎng)法，采用觀察細胞病變(CPE)和噻唑藍(MTT)比色法檢測細胞活性，觀察復方大果木姜子軟膏提取物抗HSVⅠ病毒感染的作用；以治療指數(shù)（TI）為評價指標，比較各處方的抗病毒活性強弱。結(jié)果復方大果木姜子軟膏Ⅰ號，Ⅱ號，Ⅲ號三個處方其水煎液及醇提液都有不同程度的體外抑制HSV1在Hep2細胞中增殖的作用；其中Ⅱ號處方的水提

2、取物作用最強。結(jié)論選用復方大果木姜子軟膏Ⅱ號處方采用水煎提取作為制劑研究的最優(yōu)處方工藝?！娟P(guān)鍵詞】復方大果木姜子軟膏；細胞培養(yǎng)實驗方法；抗病毒活性；處方篩選大果木姜子CinnamomummigaoH.I1640培養(yǎng)（GIBCO公司）；胰酶（GIBCO公司）；新生牛血清（杭州四季青生物制劑公司）；平衡鹽液：Hanks液；噻唑鹽（MTT，北京天港邦定生物醫(yī)學科技有限公司），其它試劑均為分析純。MTT溶液：稱取50mgMTT，放入小燒杯中，加入50ml維持液，過0.22μm的微孔濾膜過濾除菌，分裝于小試管中，放于－4℃冷藏室中保存，兩周內(nèi)有效。RPMI1640培養(yǎng)液：含10%新生牛血清的R

3、PMI1640培養(yǎng)液（含1×105u·L-1青霉素，100mg·L-1鏈霉素，0.2%heps）。維持液：成分同營養(yǎng)液，但小牛血清濃度為2%。臨用前用5.5%碳酸氫鈉液調(diào)pH值為7.4，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｏ海阂鹊鞍酌敢海?.25%胰蛋白酶加入0.01%EDTA，0.22μm的微孔濾器除菌）。使用前用5.5%NaHCO3調(diào)整pH值為7.6?！　?.2藥物的制備以大果木姜子精油為主，分別配伍：珊瑚姜、杠板歸、飛龍掌血、苦參、土荊皮、蛇床子、花椒等藥物組成Ⅰ～Ⅲ號方。①號、③號、⑤號試驗藥物用70%的乙醇加熱回流提?、裉枺蛱?，Ⅲ號3個處方，另加入超臨界萃取的大果木姜子精油及0.5%吐溫

4、80作為增溶劑，攪拌混勻，即得。②號，④號，⑥號試驗藥物用水煎煮提?、裉?，Ⅱ號，Ⅲ號3個處方，另加入超臨界萃取的大果木姜子精油及0.5%吐溫80作為增溶劑，攪拌混勻，即得。以上藥物用0.22μm的微孔濾器除菌。本實驗中所列藥物的濃度是按原生藥濃度計算（大果木姜子精油按出油率為10%計算）?！　?.3儀器二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(Thermoelectroncorporation)；超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠)；數(shù)字照相機：NikondigitalcamraTEF1200F；倒置顯微鏡：尼康TS100F；低速離心機：LD42(北京醫(yī)用離心機廠)；通用酶標儀BIOTEXELX800uv

5、（美國產(chǎn)品）?！　?.4細胞細胞株：Hep2人喉癌細胞(細胞株由貴陽醫(yī)學院免疫學教研室保存)?！　?.5病毒株病毒株：HSV1，由貴陽醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院——組織培養(yǎng)及干細胞研究中心提供。在Hep－2細胞上復壯三代，傳代增殖后，分裝使用。　　2方法　　2.1病毒滴度的測定用含2%新生牛血清的RPMI－1640維持液將病毒稀釋成10，102，103，104，105，106，107，108，109，1010倍10個濃度，按常量分別加入已長成單層細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中，置于37℃，5%CO2溫箱內(nèi)孵育2h，棄去含病毒維持液，更換正常細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，分別于1，2，3，4，5，6，7d在倒

6、置顯微鏡下觀察記錄細胞病變(CPE)程度。同時正常細胞對照。計算細胞半數(shù)感染量(TCID50)?！　?.2藥物對細胞的毒性檢測細胞用胰酶消化后，用培養(yǎng)液配成細胞密度為1×105/ml單細胞懸液，接種于平底型96孔培養(yǎng)板中（每孔加入0.2ml），適應(yīng)生長24h，至細胞生長呈單層。①～⑥號藥液分別用維持液進行二倍量系列稀釋，把不同濃度的藥液加入到培養(yǎng)板中（100μl/孔），每個劑量組設(shè)4孔細胞。用透明膠帶封口后，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，同時設(shè)另設(shè)正常細胞。培養(yǎng)72h后，觀察細胞病變(CPE)情況；并用噻唑藍(MTT)比色法［5］檢測細胞活性計算存活細胞的百分比。按Reed-Meuench法計算

7、各處方藥物對細胞的半數(shù)毒性濃度(50%CytotoxityConcentration,CC50)。細胞存活率(%)=試驗孔平均OD值對照孔平均OD值×100%藥物對細胞生長的半數(shù)毒性濃度(CC50)CC50＝Antilog［B+（50-<50%抑制百分率/>50%抑制百分率-＜50%抑制百分率）×C］式中C=A-B；A=log(>50%藥物濃度)；B=log(<50%藥物濃度)　　2.3測定各處方對HSV－1