微孔板―酶標(biāo)儀法在rh陰性稀有血型庫建立中的應(yīng)用

《微孔板―酶標(biāo)儀法在rh陰性稀有血型庫建立中的應(yīng)用》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。

1、微孔板―酶標(biāo)儀法在Rh陰性稀有血型庫建立中的應(yīng)用【關(guān)鍵詞】微孔板建立Rh陰性稀有血型庫需要從大量獻(xiàn)血者中篩查，工作量大、檢測成本較高。而檢測Rh血型采用經(jīng)典的試管法操作繁瑣、肉眼判斷結(jié)果缺乏客觀性，不適合于大批量標(biāo)本的檢測；采用平板法也存在試驗(yàn)敏感性不足和不易標(biāo)準(zhǔn)化操作的缺點(diǎn)。針對上述缺點(diǎn)，筆者經(jīng)反復(fù)摸索，建立了微孔板―酶標(biāo)儀微量法（微板法），經(jīng)常規(guī)8650份標(biāo)本的檢測，符合率為100%。.L.編輯。1材料與方法1.1標(biāo)本經(jīng)EDTA-K2抗凝的無償獻(xiàn)血者全血標(biāo)本。1.2試劑抗-D血型（中山生科公司）。1.3器材平底微孔反應(yīng)板（國產(chǎn)）；

2、ID2S-2型平板離心機(jī)；TITRAMAX1011型振蕩儀；MultisKanMK3型酶標(biāo)儀；進(jìn)口微量移液器。1.4方法微板法：將抗-D血清25μl和稀釋成一定比例的待檢紅細(xì)胞10μl加到平底微孔反應(yīng)板中，用振蕩儀在一定條件下振蕩均勻，再經(jīng)平板離心機(jī)以1000r/min，離心1min，再用振蕩儀在一定條件下振蕩懸浮。凝集的紅細(xì)胞塊散于孔底，不凝集的紅細(xì)胞呈混懸狀態(tài)。用酶標(biāo)儀630nm波長自動(dòng)掃描，獲取每孔的相對透光率（Tc）。試管法和平板法同常規(guī)血型鑒定方法。2結(jié)果2.1振蕩條件的選擇在混勻及懸浮過程中各選8個(gè)標(biāo)本（陰、陽性標(biāo)本各4孔

3、），在微孔中用上述方法加入抗-D血清和紅細(xì)胞，用5、6、7檔不同振幅，振蕩時(shí)間分別為5、10、15、20、25、30s，振幅大小與震蕩時(shí)間成反比，最終選擇混勻條件6檔振幅15s，懸浮條件6檔振幅20s。2.2凝集試驗(yàn)與非凝集試驗(yàn)結(jié)果與透光率的關(guān)系選40個(gè)凝集（Rh陽性）和20個(gè)非凝集（Rh陰性）標(biāo)本，自然沉降后取紅細(xì)胞從原濃度到1∶32稀釋度做倍比稀釋，然后每孔按上述方法重復(fù)測3次，得到每孔的平均Tc，見表1。凝集試驗(yàn)中紅細(xì)胞從原濃度到1∶32稀釋度時(shí)與透光率呈線形關(guān)系（n=4，tr=0.98＞t0.01（4）=0.917,P＜0.0

4、1）；非凝集試驗(yàn)中紅細(xì)胞從原濃度到1∶32稀釋度時(shí)與透光率雖不是線形關(guān)系（n=3，tr=0.49＜t0.01（3）=0.959,P＞0.01），但其值在一定范圍內(nèi)波動(dòng)，且隨著稀釋度的升高，透光率很快上升。紅細(xì)胞在1∶8稀釋度時(shí)，凝集反應(yīng)和非凝集反應(yīng)的Tc值相差最大。故本試驗(yàn)將自然沉降的紅細(xì)胞按1∶8稀釋后的濃度作為工作濃度。表1凝集試驗(yàn)與非凝集試驗(yàn)中RBC稀釋度與透光率的關(guān)系2.3敏感性將抗-D血清倍比稀釋，分別用微板法、試管法和平板法檢測60份Rh陽性標(biāo)本，結(jié)果見表2。微板法的敏感性略高于平板法，但低于試管法。2.4陰性反應(yīng)與陽性反

5、應(yīng)參數(shù)的界定根據(jù)試驗(yàn)2（40份1∶8）和試驗(yàn)3（60份原血清）共100份Rh陽性標(biāo)本的平均Tc69.1%，s9.2，（-2s）為50.7%。根據(jù)試驗(yàn)2（20份1∶8）Rh陰性標(biāo)本的平均Tc12.2%，s2.6，（+2s）為17.4%。從而決定Tc≥50.0%為陽性，Tc≤17.0%為陰性，17%＜Tc＜50%為可疑，可疑者需用試管法重新鑒定。表2Rh血型敏感性試驗(yàn)2.5影響因素為探討溶血對本試驗(yàn)的影響，用蒸餾水將標(biāo)本完全溶血，再配成不同濃度的血紅蛋白液，用上述微板法檢測透光率。得出溶血后透光率在18%~50%之間，可使Rh陽性標(biāo)本的透

6、光率偏低，可使Rh陰性標(biāo)本的透光率偏高，均處于灰區(qū)，從而不能自動(dòng)正確的判讀結(jié)果。2.6可重復(fù)性取48份標(biāo)本，按上述方法連續(xù)檢測3次，36份Rh陽性標(biāo)本的結(jié)果均為陽性，12份Rh陰性標(biāo)本的結(jié)果也均為陰性，因此有良好的可重復(fù)性。2.7準(zhǔn)確率8650份標(biāo)本用微板法和平板法分別檢測，任意一種方法檢測陰性標(biāo)本和微板法檢測可疑標(biāo)本用經(jīng)典試管法復(fù)查。微板法陰性標(biāo)本一次判讀結(jié)果準(zhǔn)確率100%（22/22），陽性標(biāo)本一次判讀出現(xiàn)可疑結(jié)果3例（3/8628），重復(fù)試驗(yàn)2例可疑結(jié)果判讀為陽性，1例仍為可疑；平板法陰性標(biāo)本一次判讀結(jié)果準(zhǔn)確率91.67%（22

7、/24）。2.8精密度取12份標(biāo)本，其中8份Rh陽性標(biāo)本，4份Rh陰性標(biāo)本，連續(xù)進(jìn)行20次測試。凝集試驗(yàn)的s9.5，cv13.2%。非凝集試驗(yàn)的s2.51，cv18.2%。值均＜20%，因此該方法具有較好的精密度。3討論本法檢測Rh血型具有較好的重復(fù)性、準(zhǔn)確性，操作簡單、快速，判讀結(jié)果客觀可靠，原始結(jié)果也易于保存，自動(dòng)化程度高，能高效篩選獻(xiàn)血者，有利于實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)化管理。本法特別適用于建立Rh陰性稀有血型庫大量血液標(biāo)本的篩查，可有效減少工作量和降低檢測成本。