小發(fā)夾rna介導(dǎo)的基因沉默及其應(yīng)用

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1、小發(fā)夾RNA介導(dǎo)的基因沉默及其應(yīng)用【關(guān)鍵詞】RNA干擾；shRNA；基因功能分析；基因治療發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA（hairpinRNA）是RNA二級結(jié)構(gòu)中最簡單的。它是由一條RNA單鏈自身折疊，形成雙鏈的莖，再加上一條單鏈的環(huán)構(gòu)成，因此，發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA又稱為莖環(huán)結(jié)構(gòu)RNA，在整個生物界中普遍存在。最近，一類特殊的發(fā)夾RNA小發(fā)夾RNA顯示參與了轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)控，這些shRNA在基因穩(wěn)定沉默中起重要的作用。shRNA介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)已經(jīng)成為研究哺乳動物細(xì)胞體內(nèi)外基因功能強有力的工具。1siRNA、stR

2、NA、miRNA與RNAiRNA干擾（RNAinterference，RNAi）是指正常生物體內(nèi)抑制特定基因表達(dá)的一種現(xiàn)象，小干擾RNA(smallinterferenceRNA,siRNA)是RNAi過程中重要的中間分子，是一類長約21～23個核苷酸(nt)的特殊雙鏈RNA(doublestrandedRNA，dsRNA)分子，與所作用的靶mRNA序列具有同源性，RNAi主要是通過dsRNA被核酸酶切割成siRNA，再由siRNA介導(dǎo)識別并靶向切割同源性靶mRNA分子而實現(xiàn)。最近，在線蟲和蠕蟲中發(fā)現(xiàn)了li

3、n4和let7RNA，這兩種RNA均來自于72nt具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體RNA，經(jīng)加工形成22nt的RNA。lin4和let7基因與發(fā)育的時序性有關(guān)，一旦突變，會引起異時序性的發(fā)育缺陷。因其與發(fā)育的時序有關(guān)，所以稱它們?yōu)閟tRNAs(smalltemporalRNAs)［1］。同時在不同的生物體中，也已發(fā)現(xiàn)90多種發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA，可產(chǎn)生21～23ntRNA，但它們不象lin4和let7一樣時序性表達(dá)，因此將它們統(tǒng)稱為miRNAs(microRNAs)［2］。stRNA、miRNA、siRNA及RN

4、Ai有何關(guān)系呢？研究發(fā)現(xiàn)，Dicer酶將siRNA和stRNA聯(lián)系起來，Dicer酶可催化長dsRNA分解成siRNA，同時還能將穩(wěn)定發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體RNA分解成21～23nt的stRNA。當(dāng)用siRNA將Hela細(xì)胞中的Dicer消除時，會發(fā)生72nt未加工的let7前體RNA的積累。同樣，在蠕蟲中去除Dicer酶，會引起發(fā)育的異時性，也會發(fā)生未加工的let7和lin4前體RNA的積累［1］。EiF2C/Argonaute家族是RNAi和stRNA的又一聯(lián)系者。當(dāng)蠕蟲EIF2C/Argonaute家族

5、中特異蛋白缺陷時，其發(fā)育呈異時性表型，同時未加工的lin4和let7前體RNA積累［3］。在植物體中，miRNA的作用機制與siRNA介導(dǎo)的mRNA降解相似。用免疫沉淀法發(fā)現(xiàn)兩種與SMN復(fù)合體（survivalofmotorneuronsplex）密切相關(guān)的蛋白GEMIN3和GEMIN4。miRNA和GEMIN3/4復(fù)合體包含了與Argonaute同源的eIF2C和Dicer酶［4］。因此，這一研究進(jìn)一步揭示了內(nèi)源性發(fā)夾miRNA與RNAi的關(guān)系。2shRNA介導(dǎo)的RNAi長發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA(500～1

6、000nt)分析基因功能的技術(shù)在低等生物中已大獲成功。在哺乳動物中，這種技術(shù)已在小鼠的胚胎干細(xì)胞中取得進(jìn)展。然而，在不同的哺乳動物體細(xì)胞中，試圖用如此長的發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA以介導(dǎo)持續(xù)的基因沉默，目前尚未成功?？赡苁且驗殚L發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA活化了干擾素（IFN）相關(guān)途徑，對基因表達(dá)缺乏特異性。為避免IFN反應(yīng)，人們正在試圖用短的dsRNA結(jié)構(gòu)來沉默靶基因。研究發(fā)現(xiàn)，小于30個nt的dsRNA能特異性抑制基因表達(dá)，而不會造成非特異性作用。在哺乳動物細(xì)胞中，shRNA可以長期甚至穩(wěn)定的發(fā)揮RNAi的作用，而不引起非特異性

7、反應(yīng)。因此如何得到shRNA是維持長期RNAi作用的關(guān)鍵。已有研究者發(fā)展了基于DNA載體在體內(nèi)表達(dá)shRNA的技術(shù)。采用事先在體外構(gòu)建能夠表達(dá)shRNA的載體，再轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄shRNA的策略。在所構(gòu)建的siRNA表達(dá)載體中，由RNA聚合酶Ⅲ啟動子來指導(dǎo)RNA合成，是因為RNA聚合酶Ⅲ一方面在體內(nèi)有較高的轉(zhuǎn)錄效率，另一方面有明確的起始和終止序列。當(dāng)RNA聚合酶Ⅲ遇到連續(xù)4個或5個T時，它指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄就會停止，在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3’端形成1～4個U，這樣就限制了RNA的大小，不會引起干擾素的非特異作用。已有研究者應(yīng)用

8、聚合酶Ⅲ啟動子鼠U6、人U6、H1RNA及ValtRNA啟動子成功構(gòu)建了siRNA表達(dá)載體［5～8］。為找到?jīng)Q定發(fā)夾結(jié)構(gòu)最佳效率的因素，有研究者觀察了不同長度的莖和環(huán)構(gòu)建的shRNA對RNAi效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，shRNA莖在18～29個核苷酸長度時，其RNAi的效果相當(dāng)，無明顯差異，但當(dāng)超過29個核苷酸時，可能引起非特異性反應(yīng)，而無RNAi作用［9］。而Paddison等［10］卻認(rèn)為，長一點的dsRNA（