急性髓性白血病患者異基因造血干細胞移植后早期t細胞免疫重建的研究

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1、急性髓性白血病患者異基因造血干細胞移植后早期T細胞免疫重建的研究：吳秀麗　李揚秋朱康兒,楊力建陳少華,盧育洪陳潔,劉啟發(fā)【摘要】目的:監(jiān)測急性髓性白血病(AML)患者接受異基因造血干細胞移植(alloHSCT)后外周血中的T細胞受體重排刪除環(huán)(TRECs)水平,了解移植后早期的T細胞免疫重建情況。方法:AML患者15例分別在alloHSCT前以及alloHSCT后每隔2周收集外周血,采用實時定量PCR法檢測外周血單個核細胞(PBMNCs)中的TRECs水平;7例年齡相近的正常人外周血樣本作為對照。流式檢測CD45R

2、A+細胞亞群和CD45RO+細胞亞群的陽性率。結(jié)果:alloHSCT組移植前的TRECs平均拷貝數(shù)為(1.42±1.51)拷貝/1000PBMNCs,明顯低于正常組的(3.03±0.45)拷貝/1000PBMNCs水平;移植后第12周的TRECs平均拷貝數(shù)為(1.67±1.93)拷貝/1000PBMNCs,與正常相比仍然較低。移植后8周內(nèi)以CD45RO+/CD4+細胞的擴增為主,而外周血TRECs水平在alloHSCT后4周左右出現(xiàn)短暫地升高趨勢,隨后又下降,至alloHSCT8周后才開始穩(wěn)步上升。有急性移植物抗宿

3、主病(aGVHD)病史的移植患者的外周血TRECs水平顯著降低,明顯低于無aGVHD病史移植患者的外周血TRECs水平。3例移植后早期復發(fā)的患者的外周血TRECs水平降至基線水平或檢測不到。結(jié)論:不同個體T細胞免疫重建時間存在差異;AML患者在alloHSCT后早期(90d內(nèi))的胸腺輸出功能仍處于恢復階段,移植后4周內(nèi)的免疫重建仍以于供者細胞的外周擴增為主;外周血TRECs水平可能與AML患者alloHSCT后病情的發(fā)展、轉(zhuǎn)歸有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】造血干細胞移植,異基因;T細胞受體重排刪除環(huán);免疫重建異基因造血干細胞移植(

4、allogeneichematopoieticstemcelltransplantation,alloHSCT)是目前治療急性髓性白血病(acutemyelogenousleukemia,AML)等惡性血液病的有效方法之一,已廣泛應用于臨床。造血干細胞移植后造血功能的全面重建主要包括兩個方面,即造血細胞數(shù)量和功能的恢復,后者主要是指免疫功能重建。臨床上往往將中性粒細胞和血小板的恢復作為造血恢復的指標,容易忽視免疫功能的恢復。免疫功能重建現(xiàn)在被認為是評價移植療效的重要因素之一,alloHSCT后重建T細胞特異性免疫功能

5、,需要于胸腺依賴途徑所產(chǎn)生的初始T細胞,即經(jīng)胸腺發(fā)育而輸出的nave細胞,而目前能夠作為naveT細胞的標志的是T細胞受體刪除DNA環(huán)(TcellreceptorexcisionDNAcircles,TRECs)[1-3]。為了解AML患者接受alloHSCT后早期的T細胞免疫重建情況,我們對其胸腺近期輸出功能(外周血TRECs水平)進行了監(jiān)測,并對外周血CD45RA+/CD4+、CD45RO+/CD4+及CD45RA+/CD8+細胞亞群進行了流式細胞術(shù)分析。　　1對象和方法　　1.1對象接受alloHSCT治

6、療的AML患者15(男13,女2)例,年齡18～56(中位年齡35.7)歲,其中M25例,M32例,M45例,M53例;供者為HLA位點完全相合同胞或無關(guān)供者;采用聯(lián)合氟達拉賓的減量清髓預處理方案;移植后受者全部植活(中性粒細胞連續(xù)3d≥0.5×109/L為粒細胞植活,血小板連續(xù)7d≥20×109/L為血小板植活),所有受者移植后均為完全供受者嵌合體;所有患者alloHSCT后臨床上未采用改變細胞亞群數(shù)量的特殊治療方案,并均告知同意及醫(yī)院倫理委員會同意。分別于移植前、移植后每間隔2周收集患者外周血樣本;同時收集7例與移

7、植組年齡相近的正常人(均為男性)外周血樣本作為對照,年齡17～48(中位年齡31.6)歲?！　?.2方法　　1.2.1流式細胞術(shù)檢測CD45分子表達和DNA提取按常規(guī)方法收集各樣本的外周血單個核細胞(PBMNCs),計數(shù)后一部分細胞用于免疫熒光標記(鼠抗人CD4+、CD8+、CD45RA、CD45ROmAb,Fermentas),利用流式細胞術(shù)進行CD45RA+/CD4+、CD45RO+/CD4+及CD45RA+/CD8+細胞亞群陽性率的檢測;剩余細胞提取DNA(QIAprepSpinMiniprepKit,QIAgen

8、),并用紫外分光光度計檢測DNA的濃度及純度?！　?.2.2引物設計從T細胞受體(TCR)δ基因組序列(ACCESSIONAE000661)中于δRec基因片段的下游設計一下游引物(T1)和在ψJα的上游設計一上游引物(T2)[2],引物的方向恰好與一般的PCR引物相反(所檢測的是δRec和ψJα的兩個基因片段刪除后