家蠅幼蟲防御素基因的克隆和序列分析

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1、家蠅幼蟲防御素基因的克隆和序列分析【摘要】目的：克隆家蠅幼蟲防御素（defensin）基因并進行序列分析。方法：根據(jù)Genbank公布的家蠅成蟲defensin基因序列設(shè)計一對引物，以家蠅幼蟲基因組DNA為模板，進行PCR擴增、測序，并利用軟件進行序列分析。結(jié)果：克隆得到的defensin基因的長度為330bp，編碼92個氨基酸，4個陽性克隆的DNA序列編碼的多肽在第27位氨基酸殘基不同，為K或N。結(jié)論：從家蠅幼蟲基因組DNA中克隆得到了defensin基因，發(fā)現(xiàn)了兩種相差一個氨基酸殘基的defensin前體蛋白，并初步預(yù)測了兩種前體蛋白的化學(xué)

2、性質(zhì)和二級結(jié)構(gòu)，為該基因的重組表達奠定了基礎(chǔ)?！娟P(guān)鍵詞】防御素類；家蠅；幼蟲；克隆，生物；序列分析　?。跘bstract］Objective:ToclonethedefensingenesofMuscadomesticalarvaeandanalyzetheirsequences．Methods:PCRenticDNAofM.domesticalarvaeastemplate,andtheprimersusedesticaadultdefensingenesequenceinGenbank.ThePCRproductsidTvector,an

3、dsequenced.Results:Theamplifiedproductsinoacids.FiveSingleNucleotidedifferencesofsequencesexitedamongfourclones.TinoacidsequencesofdefensingeneM.domesticalarvaeinthisexperiment.Conclusion:DefensingeneofM.domesticalarvaehasbeenclonedsuccessfully.T;sequenceanalysis濫用抗生素帶來了日益嚴(yán)重

4、的微生物對抗生素的耐藥性問題，因此發(fā)現(xiàn)和篩選具有新的作用機理的抗菌藥物已經(jīng)成為當(dāng)前醫(yī)藥研究領(lǐng)域的迫切任務(wù)。昆蟲抗菌肽是一類生物活性小分子肽，具有熱穩(wěn)定性強、殺菌力強、抗菌譜廣和無免疫原性的特點，可以抑殺某些真菌、細菌、病毒及原蟲，并對多種癌細胞及動物實體瘤有明顯的殺傷作用,且不會破壞正常細胞[1，2]，其突出的優(yōu)勢在醫(yī)藥領(lǐng)域展示出良好的應(yīng)用前景，將成為新一代的抗菌、抗病毒、抗癌藥物。家蠅(Muscadomestica)與其他昆蟲相比對病原微生物有著更為強大的免疫力，大量的研究結(jié)果顯示家蠅的強大免疫力正是因為體內(nèi)存在著抗菌[3]、抗病毒[4]、抗

5、真菌[5]的活性分子。防御素（defensin）是抗菌肽家族中最為普遍的一類，并且在不同物種中有很高的保守性，具有廣譜的抗菌和調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)的作用。由于天然抗菌肽的少，純化工藝的難度與高成本，無法滿足臨床試用和基礎(chǔ)研究的需要。因此，通過基因工程技術(shù)生產(chǎn)防御素，無疑是降低成本和大量生產(chǎn)的有效途徑。近年來，王來城[6]和許琴英[7]分別通過構(gòu)建cDNA文庫先后克隆了廣東家蠅幼蟲和山東家蠅成蟲的defensin基因，家蠅防御素在大腸桿菌和畢赤酵母中的表達也獲得了初步成功[8，9]；王婷婷等[10]構(gòu)建了有利于家蠅defensin基因高效表達的同向串

6、聯(lián)表達載體。在這些研究中，家蠅防御素基因的獲得均是通過從抽提家蠅RNA或是建立的cDNA文庫中來擴增該基因，目前尚未見從家蠅基因組中克隆defensin基因的報道。本研究以貴州貴陽的家蠅幼蟲作為實驗材料，直接抽提幼蟲基因組DNA，用PCR方法克隆defensin基因，并與其cDNA相比較，了解其基因結(jié)構(gòu)，為下一步建立該基因高效穩(wěn)定的表達體系奠定基礎(chǔ)。　　1材料與方法　　1.1材料　　1.1.1家蠅幼蟲　　由貴陽醫(yī)學(xué)院昆蟲分子生物學(xué)實驗室提供?！　?.1.2E．coliJM109菌株　　本實驗室保存的E.coliJM109菌株，Taq聚合酶、DN

7、AMarker、pMD-18T載體試劑盒、M13引物、限制性內(nèi)切酶等購自大連寶生物公司，PCR引物由大連寶生物公司合成，其余試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。　　1.2方法　　1.2.1基因組DNA的提取　　取3只三齡幼蟲，約30g，參照安春菊[11]的方法抽提幼蟲基因組DNA?！　?.2.2PCR擴增和產(chǎn)物鑒定　　擴增反應(yīng)體系為50μl，模板DNA1μl，10×PCRBuffer5μl，TaqDNA聚合酶0.5μl，25mmol/LdNTPs4μl，10μmol/L物引2μl，水35.5μl。PCR擴增程序為：94℃預(yù)變性2min后進入擴增循環(huán)，94

8、℃變性40s，56℃退火50s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳0.5h,溴化乙錠染色法檢