資源描述:
《家蠅cdna文庫的構(gòu)建及防御素基因的分子克隆》由會員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、家蠅eDNA文庫的構(gòu)建及防御素基因的分子克隆摘要fI昆蟲的生活環(huán)境分布廣泛,因此具有極強(qiáng)的免疫力。-9高等動物不同,昆蟲體內(nèi)沒有淋巴細(xì)胞,不能合成免疫球蛋白。"-3昆蟲受致病菌的侵染或體壁受到機(jī)械損傷時(shí),體內(nèi)迅速合成一類多肽物質(zhì),能殺滅致病菌,稱之為抗菌肽。自從1980年Boman等從天蠶中分離、純化出第一種天然抗菌肽一天蠶素(ceeropin)以來,已經(jīng)有400多種抗菌肽從其他種類的無脊椎動物和脊椎動物中被分離、純化出來??咕木哂蟹肿恿啃?、熱穩(wěn)定性好、水溶性好、無免疫原性和抗菌譜廣的特點(diǎn)。對昆蟲抗菌肽的研究,為抗菌和抗癌藥物的研究及其應(yīng)用開辟了廣闊的前景。從昆蟲中提取天然的抗菌肽既費(fèi)時(shí)
2、又費(fèi)力,但可以克隆出抗菌肽基因,再進(jìn)行重組表達(dá),利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)、開發(fā)抗菌藥物。y77本文以經(jīng)大腸桿菌(E.colO和金黃色葡萄球菌(Staph)·lococcusaureus)誘導(dǎo)24小時(shí)的家蠅為材料,用異硫氰酸胍:酚:氯仿一步法,從家蠅腹部提取出完整的總RNA。然后采用親和層析的方法,分離、純化出mRNA,逆轉(zhuǎn)錄合成eDNA,兩端加上EeoRI/NotI接頭之后,-9表達(dá)載體kgtll連接,經(jīng)體外包裝構(gòu)建成了家蠅抗菌肽cDNA文庫。文庫的滴度達(dá)到了3.46×105pfu/ml,重組率為99.6%。這為以后家蠅抗菌肽基因的克隆奠定了基礎(chǔ)。根據(jù)昆蟲防御素(defensin)的同源氨基酸
3、序列設(shè)計(jì)一對簡并引物,PCR擴(kuò)增用于構(gòu)建文庫的eDNA,將目的片段進(jìn)行克隆、測序,得到了長為119bp的家蠅防御素基因片段,經(jīng)基因庫Blast檢索證明為一新基因,-9Aedesalbo的防御素defensinD的基因序列相似性達(dá)到76%,為進(jìn)一步的文庫篩選或進(jìn)行3/、5/RACE而獲得全長序列奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞:家蠅抗菌肽防御素cDNA文庫分子克隆山東趕學(xué)理學(xué)碩士論文CoNSTRUCTIONoFcDNALIBRARYoFHOUSEFLY(MUSCADD心"c)ANDMoLECULARCLoNlNGoFDEFENSINGENEAbstractInsectsliveiflavaribleenv
4、ironment,SOtheyhavestrongimmunity.Differentfromhighanimals.insectslackoflymphocytesandcannotsynthesizeimmunodobulins.1hiectionofliveorkilledbacterialandevenasimpleinjury,caninducetherapidappearranceofseveralfamiliesofantibacterialpeptidesinthehaemolymph.Sincethefirstantibacterialpepfide,cecropin,w
5、aspurifiedfromCecorpiawoth(Hyalophoracecropia)byBomanifl1980.morethan400kindsofantibacterialpeptideshavebeenpurifiedfromotherkindsofifivertibratesandvertibrates.Thereseachhasrealedt11attheyarenovel.mostlycationic,small—sizedpeptideswithabroadspectrumofactivityagainstGram—positiveand/orGram—negativ
6、ebacteria.Itlsdifflcultandtime—consumingtopurlfynatureantibacterialpepridesfrominseets.butitisfeasibletoclonethegenesofantibacterialpeptides.tranferthemintotheexpressionsystems,andgetthemedicinebythemethodofgeneticengineering.Inthethesis.totalRNAwasextractedfromtheabdomenofHouseFlyinducedafter24ho
7、ursbyEcoliandStaphylococcusaureuswithGuanidiniumIsothiiocyanate,PhenolandChloroforlTlsingle.stepmethod.Poly(A)+RNAwasisolatedfromtotalRNAusingthemRNAPurificationKitfromPharmacia.ThenthemRNAwasreverselytranscribed