家蠅cdna文庫的構(gòu)建及防御素基因的分子克隆

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1、家蠅eDNA文庫的構(gòu)建及防御素基因的分子克隆摘要fI昆蟲的生活環(huán)境分布廣泛，因此具有極強(qiáng)的免疫力。-9高等動物不同，昆蟲體內(nèi)沒有淋巴細(xì)胞，不能合成免疫球蛋白。"-3昆蟲受致病菌的侵染或體壁受到機(jī)械損傷時(shí)，體內(nèi)迅速合成一類多肽物質(zhì)，能殺滅致病菌，稱之為抗菌肽。自從1980年Boman等從天蠶中分離、純化出第一種天然抗菌肽一天蠶素(ceeropin)以來，已經(jīng)有400多種抗菌肽從其他種類的無脊椎動物和脊椎動物中被分離、純化出來?？咕木哂蟹肿恿啃?、熱穩(wěn)定性好、水溶性好、無免疫原性和抗菌譜廣的特點(diǎn)。對昆蟲抗菌肽的研究，為抗菌和抗癌藥物的研究及其應(yīng)用開辟了廣闊的前景。從昆蟲中提取天然的抗菌肽既費(fèi)時(shí)

2、又費(fèi)力，但可以克隆出抗菌肽基因，再進(jìn)行重組表達(dá)，利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)、開發(fā)抗菌藥物。y77本文以經(jīng)大腸桿菌(E．colO和金黃色葡萄球菌(Staph)·lococcusaureus)誘導(dǎo)24小時(shí)的家蠅為材料，用異硫氰酸胍：酚：氯仿一步法，從家蠅腹部提取出完整的總RNA。然后采用親和層析的方法，分離、純化出mRNA，逆轉(zhuǎn)錄合成eDNA，兩端加上EeoRI／NotI接頭之后，-9表達(dá)載體kgtll連接，經(jīng)體外包裝構(gòu)建成了家蠅抗菌肽cDNA文庫。文庫的滴度達(dá)到了3．46×105pfu／ml，重組率為99．6％。這為以后家蠅抗菌肽基因的克隆奠定了基礎(chǔ)。根據(jù)昆蟲防御素(defensin)的同源氨基酸

3、序列設(shè)計(jì)一對簡并引物，PCR擴(kuò)增用于構(gòu)建文庫的eDNA，將目的片段進(jìn)行克隆、測序，得到了長為119bp的家蠅防御素基因片段，經(jīng)基因庫Blast檢索證明為一新基因，-9Aedesalbo的防御素defensinD的基因序列相似性達(dá)到76％，為進(jìn)一步的文庫篩選或進(jìn)行3／、5／RACE而獲得全長序列奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：家蠅抗菌肽防御素cDNA文庫分子克隆山東趕學(xué)理學(xué)碩士論文CoNSTRUCTIONoFcDNALIBRARYoFHOUSEFLY(MUSCADD心"c)ANDMoLECULARCLoNlNGoFDEFENSINGENEAbstractInsectsliveiflavaribleenv

4、ironment，SOtheyhavestrongimmunity．Differentfromhighanimals．insectslackoflymphocytesandcannotsynthesizeimmunodobulins．1hiectionofliveorkilledbacterialandevenasimpleinjury，caninducetherapidappearranceofseveralfamiliesofantibacterialpeptidesinthehaemolymph．Sincethefirstantibacterialpepfide，cecropin，w

5、aspurifiedfromCecorpiawoth(Hyalophoracecropia)byBomanifl1980．morethan400kindsofantibacterialpeptideshavebeenpurifiedfromotherkindsofifivertibratesandvertibrates．Thereseachhasrealedt11attheyarenovel．mostlycationic，small—sizedpeptideswithabroadspectrumofactivityagainstGram—positiveand／orGram—negativ

6、ebacteria．Itlsdifflcultandtime—consumingtopurlfynatureantibacterialpepridesfrominseets．butitisfeasibletoclonethegenesofantibacterialpeptides．tranferthemintotheexpressionsystems，andgetthemedicinebythemethodofgeneticengineering．Inthethesis．totalRNAwasextractedfromtheabdomenofHouseFlyinducedafter24ho

7、ursbyEcoliandStaphylococcusaureuswithGuanidiniumIsothiiocyanate，PhenolandChloroforlTlsingle．stepmethod．Poly(A)+RNAwasisolatedfromtotalRNAusingthemRNAPurificationKitfromPharmacia．ThenthemRNAwasreverselytranscribed