寧夏地區(qū)綿羊博爾納病病毒自然感染狀況研究

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1、寧夏地區(qū)綿羊博爾納病病毒自然感染狀況研究：劉建，馬彥，王振海，謝鵬【摘要】目的探討中國寧夏地區(qū)綿羊博爾納病病毒(Bornadiseasevirus，BDV)的自然感染狀況，并分析比較中國寧夏地區(qū)綿羊自然感染BDVp24基因序列與國外人和動物BDV分離株及其標準株StrainV和He/80的同源性。方法采用巢式逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR(FQ-nRT-PCR技術(shù))檢測了中國寧夏地區(qū)268例綿羊PBMCs中BDVp24基因片段，對陽性標本FQ-PCR產(chǎn)物進行基因序列測定，測序結(jié)果應(yīng)用BLAST軟件以及DNAsist5.0軟件對測序結(jié)果分析，與國外人與動物的BDV分離株以及標準株Strain

2、V和He/80進行序列比較。結(jié)果268例中4例綿羊外周血BDVp24基因片段陽性，陽性率為1.49%;測序分析結(jié)果表明，寧夏地區(qū)綿羊感染的BDVp24的核苷酸序列與馬源性病毒株H3575同源性最近，同源性為98.84%(85/86)，與標準株StrainV和He/80同源性為94.19%和100%。并且它們編碼的氨基酸序列相同。結(jié)論寧夏地區(qū)綿羊中可能存在動物源性的BDV自然感染，該地區(qū)感染的BDVp24核苷酸序列與馬源性病毒株H3575、標準株StrainV和He/80存在高度的同源性，其感染可能相同亦或存在相互之間感染的可能【關(guān)鍵詞】Borna病病毒;感染;巢式逆轉(zhuǎn)錄熒光定量P

3、CR博爾納病病毒(Bornadiseasevirus，BDV)是一種非分節(jié)段的單股負鏈嗜神經(jīng)的RNA病毒，是引起人和動物共患病博爾納病(BornaDisease，BD)的病原體[2]，感染后主要侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)導(dǎo)致嚴重后果，有可能引起動物之間的傳染而引起大規(guī)模動物死亡。迄今為止，中國雖未見大規(guī)模的BDV流行報道，但有報道在新疆、重慶、寧夏以及臺灣地區(qū)的馬、牛、人等存在散在BDV自然感染。本研究應(yīng)用FQ-nRT-PCR技術(shù)檢測寧夏地區(qū)268例綿羊外周血單個核細胞(PBMCs)中BDVp24基因片段，對陽性標本FQ-PCR產(chǎn)物進行克隆和測序分析，以探討中國寧夏地區(qū)綿羊BDV自然感染狀

4、況，進而比較分析中國綿羊自然感染的BDV與國外人和動物BDV分離株及其標準株StrainV和He/80在種系發(fā)生中的關(guān)系?！　?材料和方法　　1.1研究對象268例綿羊均來自寧夏地區(qū)，每例采外周血5mL，EDTA抗凝?！　?.2主要試劑及儀器主要試劑：淋巴細胞分離液(Ficoll-conray液)，TrizolRNA提取液(購自BioFlux)，Borna病病毒熒光定量PCR診斷試劑盒(廣州達暉生物技術(shù)有限公司)，PE7700FQ-PCR(美國ABI公司)。　　主要實驗儀器：752紫外光柵分光光度計(上海第三分析儀器廠)，Bio-RadPCR儀(日本)，Heraeus低溫高速離心

5、機(德國)，Rotor-Gene6000熒光PCR儀(澳大利亞)，SANYOULTRALOCs，再按照RNAisoTMPlusRNA提取試劑提取總RNA。提取的RNA保存在-80℃冰箱。2)對RNA樣本進行純度檢測、濃度計算和完整性檢測：將上述保存于-70℃冰箱中的綿羊PBMCsRNA樣本隨機取出4例，4℃8000r·min-1離心5min，棄上清液;再用75%乙醇重復(fù)洗滌，4℃8000·min-1離心5min，吸干殘余液，RNA沉淀置室溫干燥15min去除殘留乙醇;加入無RNase水50μL，55℃水浴10～15min溶解RNA;取5μL提取的RNA稀釋100倍，用紫外分光光度

6、計測OD260、OD280及二者比值，計算RNA濃度，公式為：OD260×核酸稀釋倍數(shù)×40/1000，單位μg·μL-1。其余RNA置-70℃冰箱中備用。采用1%瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠濃度為0.5μg·μL-1)電泳。取RNA樣品10μL上樣，以3～4V·cm-1的電壓電泳25min，在凝膠成像分析儀中觀察結(jié)果并照相。3)FQ-nRT-PCR檢測BDVp24基因片段陽性定量標準曲線的建立：將鑒定好的質(zhì)粒(重慶醫(yī)科大學(xué)提供)測定OD值，計算拷貝數(shù)，按107、106、105、104、103拷貝數(shù)·μL-1濃度梯度稀釋，加5μL于不同反應(yīng)管中，在PE7700FQ-PCR上進行擴增。同

7、時每8s檢測1次PCR產(chǎn)物的量(即反應(yīng)管中熒光值Rn的變化)。其原理是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上，在反應(yīng)體系中加入了一種帶有2個熒光基團標記的特異性寡核苷酸探針進行FQ-PCR。所有反應(yīng)信息資料被Opticon-2FQ-PCR擴增儀收集并儲存于其附件Macintosh電腦分析軟件中，反應(yīng)結(jié)束后該電腦根據(jù)陽性定量標準模板的擴增情況自動繪制出標準曲線。　　1.3.2FQ-nRT-PCR按Borna病病毒熒光定量PCR診斷試劑盒說明進行。首先進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在含樣本RNA的反應(yīng)管中加入下列逆轉(zhuǎn)