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1、ApoTome光學(xué)成像系統(tǒng)技術(shù)與應(yīng)用ApoTome光學(xué)成像系統(tǒng)劉進席超北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)儀器2010第8卷/2月刊摘要熒光顯微鏡已被廣泛地應(yīng)用于生物樣本的熒光成像.然而在觀察較厚樣本時,來自非焦平面的熒光信息會使熒光圖像變得模糊對比度不夠背景較亮.甚至有的時候一些很蕈導(dǎo)的結(jié)構(gòu)因此被掩蓋而無法被觀察到.目前有很多種光學(xué)切片方法可以用來去除這種非焦平面熒光的影響,例如激光共聚焦掃描顯微技術(shù)或3D去卷積技術(shù)等.本文介紹了一種可以在普通熒光顯微鏡上實現(xiàn)光學(xué)切片成像的方法,并著重介紹了ApoTome光學(xué)成像系統(tǒng)的構(gòu)造和原理.光學(xué)切片顯微技術(shù)已被廣泛地應(yīng)用于生物
2、樣本的三維熒光成像.目前最為常用的光學(xué)切片顯微技術(shù)是激光共聚焦掃描顯微鏡(confocallaserscanningmicroscope,CLSM),CLsM利用點掃描的方法獲得清晰的光學(xué)切片.1997年,M.A.A.Neil等介紹了另外一種光學(xué)切片成像技術(shù)——結(jié)構(gòu)光學(xué)顯微鏡(structuredilluminationmicroscopy,SIM),利用該方法可以在一臺普通的熒光顯微鏡上實現(xiàn)光學(xué)切片成像….1.SIM成像原理普通熒光顯隨在觀察較厚的生物樣本時,例如觀察組織切片中的多層細胞.由于受非焦平面雜散熒光的干擾,使得所獲取的熒光圖像變得模糊,對比度不夠,圖
3、像信噪比不過高.甚至有時候一些很重要的結(jié)構(gòu)因此被掩蓋在背景之中,而無法被觀察到.SIM是將刻有均勻暗條紋的柵格插入熒光光路中(光路圖如圖1所示),因此從顯微鏡中觀察到的焦平面的圖像中有條紋的投影.帶有柵格的圖像中包含了樣本不同結(jié)構(gòu)與焦平面不同距離的信息.有些樣本的結(jié)構(gòu)在焦平面內(nèi),而有的在焦平面的上方或者下方也進入了焦平面內(nèi).來自非焦平面的熒光信息在圖像中顯示為比較模糊的區(qū)域.當(dāng)柵格移動時,這部分區(qū)域的來自焦平面熒光信號的亮度(對比度)會顯著提高,而來自非焦平面熒光信號的亮度仍然是比較模糊的.根據(jù)這種亮度的差異,可以用來區(qū)分熒光信號是否來自于焦平面,最后再用一種算法
4、公式通過圖像處理軟件將三張原始圖片進行計算和整合,最終得出一張全部來自焦平面熒光信號的清晰圖像.該方法也被稱為條紋投影成像技術(shù)-61.圖1:SIM成像光路示意圖2.ApoTome光學(xué)成像系統(tǒng)介紹德國ZEISS公司基于SIM的成像原理研發(fā)出了ApoTome光學(xué)成像系統(tǒng),該系統(tǒng)就是應(yīng)用條紋投影成像技術(shù)來去除非焦平面熒光影響的.一套ApoTome光學(xué)成像系統(tǒng)主要由以下幾個組件所組成.2,1一臺普通的正置或倒置熒光顯微鏡顯微鏡上要求預(yù)留有安裝ApoTome插片的位置,例如ZEISS公司的AxioImager.Z1/D1,AxioObserver.Z1/D1等產(chǎn)品均可擴展成
5、為ApoTome成像系統(tǒng).2.2ApoTome插片ApoTome插片中裝有高精度的馬達和條紋柵格,作者簡介:劉進,男,博t通訊地址:北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院郵編:l00875職稱:T程師E—mail:liujin@bnu.edu.(tn電話:OlO-5880868810第8卷/2月刊技術(shù)與應(yīng)用的馬達可以使柵格移動至三個特定位:可以獲得二=三張不同的數(shù)碼原始圖像.校準(zhǔn)工具箱配有相應(yīng)的校準(zhǔn)工具,用于相位校準(zhǔn)準(zhǔn).,計算機和AopTome控制軟件原始熒光圖像,并經(jīng)計算機處理之后的清晰圖像.le成像效果及特點:成像系統(tǒng)所收集的原始圖片如圖2所扣包含了熒光信號信息和均勻的暗色
6、條空過計算機處理之后可以生成一張最終.不使用ApoTome成像系統(tǒng)所獲取的如圖4所示.經(jīng)對比之后不難發(fā)現(xiàn),經(jīng)系統(tǒng)所獲取的圖像與普通熒光圖像相比,像中的柵格投影后能有效地去除非焦平,顯著地增強了圖像的銳利度和對比度.■■圖2:帶有柵格的原始圖像圖3:經(jīng)過處理之后的圖像目4:普通熒光顯微鏡的圖像(以上由AxioOberverZ1顯微鏡,ECPlan—Neofluar63x/1.25Oil物鏡所成像)ApoTome成像系統(tǒng)主要具有以下特點:3.1圖像收集和處理的時間較短由于ApoTome成像系統(tǒng)采用的是寬場照明成像,所以與CLSM的點掃描成像相比所需的時間相對較快.其圖
7、像處理的時間取決于圖像的大小,一張512x512圖像約需30ms,一張1300×1000圖像約需lOOms~.3.2圖像的縱向分辨率均一性較好ArwedWeigel等比較TApoTome成像系統(tǒng)與CLSM的分辨率差異.研究結(jié)果表明,觀察熒光微球時,ApoTome的縱向分辨率不如CLSM,而橫向分辨率與普通寬場熒光顯微鏡相比有很大的改善;觀察較均勻的熒光切片時,ApoTome的縱向分辨率的均一性要優(yōu)于CLSM[83.4.展望ApoTome系統(tǒng)可以從熒光樣本中獲得光學(xué)切面.非焦平面的熒光能被很好地去除,可以增強圖片的銳利度,增強信噪比(對比度),增強軸向的分辨率.同時
8、可使用傳統(tǒng)
