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《農(nóng)桿菌介導(dǎo)iaam 基因黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、農(nóng)桿菌介導(dǎo)iaaM基因黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立蘇紹坤,劉宏宇,秦智偉*（（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）收稿日期：2004-03-21基金項目：國家高科技研究發(fā)展計劃(863)資助項目(2002AA27013)作者簡介：蘇紹坤(1978-),男,黑龍江人,碩士研究生,研究方向?yàn)槭卟朔肿舆z傳育種。*通訊作者E-mail:qzw303@126.com摘要：以已經(jīng)建立的高頻黃瓜再生體系為基礎(chǔ),從影響黃瓜轉(zhuǎn)基因體系的農(nóng)桿菌侵染時間,共培養(yǎng)時是否加入乙酰丁香酮等因素優(yōu)化了黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系;將單性結(jié)實(shí)基因iaaM以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入到東
2、農(nóng)649品種黃瓜子葉節(jié)中,經(jīng)過不定芽誘導(dǎo)和生根等過程獲得了轉(zhuǎn)基因株系,通過特異性引物的PCR鑒定,40個株系擴(kuò)增出iaaM目的基因片段。PCR-Southern檢測為陽性。轉(zhuǎn)基因陽性植株移栽到溫室中,其果實(shí)經(jīng)檢測80%為單性結(jié)實(shí)黃瓜。關(guān)鍵詞：黃瓜;單性結(jié)實(shí)基因iaaM;遺傳轉(zhuǎn)化;抗性鑒定轉(zhuǎn)基因技術(shù)在黃瓜上的應(yīng)用一直受再生頻率和遺傳轉(zhuǎn)化頻率低的限制,國內(nèi)外從事黃瓜體外再生研究主要是從原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)入手[1-2],這些方法同樣難以提高遺傳轉(zhuǎn)化頻率。因此,建立一個高效的再生及遺傳轉(zhuǎn)化體系對黃瓜轉(zhuǎn)基因研究具有十分重要的意義。黃瓜在我
3、國栽培廣泛,在蔬菜生產(chǎn)和國民經(jīng)濟(jì)中均占有一定的地位。我國保護(hù)地栽培的面積正不斷擴(kuò)大,目前,黃瓜的栽培面積僅次于番茄居第二位,所用的品種多為長春密刺、津春系列和津優(yōu)系列等,這些品種在其開花坐果期往往受到低溫的影響或遇到多陰連雨的天氣將導(dǎo)致授粉受精不良、結(jié)果率低、果實(shí)易表現(xiàn)畸形而導(dǎo)致減產(chǎn)和降低果實(shí)的商品性。若進(jìn)行人工授粉或飼放蜜蜂授粉,則增加生產(chǎn)成本,降低效益,而單性結(jié)實(shí)品種可以克服以上缺陷。本實(shí)驗(yàn)將單性結(jié)實(shí)基因iaaM導(dǎo)入黃瓜中,增加子房中生長素的含量,提高轉(zhuǎn)基因植株的單性結(jié)實(shí)率,不僅為黃瓜的育種提供了單性結(jié)實(shí)能力的新材料,而且還為分子水平
4、上的黃瓜果實(shí)發(fā)育研究打下基礎(chǔ),為甜瓜,西瓜等其它園藝作物的單性結(jié)實(shí)研究提供參考。1材料與方法1.1植物材料及無菌苗培養(yǎng)黃瓜親本品種649由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院瓜類課題組提供;黃瓜種子在50%次氯酸鈉中消毒10min,在70%酒精中消毒30s,無菌水沖洗5~6次,然后接種于瓊脂固體培養(yǎng)基。在組織培養(yǎng)室中培養(yǎng)得無菌苗。1.2根癌農(nóng)桿菌及其質(zhì)粒采用根癌農(nóng)桿菌LBA4404菌株,其中含質(zhì)粒pCAM-2A12iaaT,該質(zhì)粒帶有單性結(jié)實(shí)基因iaaM和抗卡那霉素(Km)篩選的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶NptⅡ基因,基因表達(dá)由啟動子2A12調(diào)控。1.3菌株的培養(yǎng)
5、將農(nóng)桿菌劃線培養(yǎng)在含有50mg·L-1卡那霉素和50mg·L-1鏈霉素,50mg·L-1利福平的YEB培養(yǎng)基上,長出菌落后,挑取單菌落接種于10mLYEB液體培養(yǎng)基中,28℃振蕩培養(yǎng),過夜。取5mL接種于50mLYEB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng),進(jìn)行2次活化。OD600=0.5～0.6時即可用于侵染。1.4影響根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效果的因素以649為主要試材,取3d苗齡的子葉節(jié)為外植體,與OD600=0.5～0.6的菌液真空侵染7min,在黑暗下共培養(yǎng)2d后,轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基進(jìn)行選擇培養(yǎng)。其間繼代2~3次。在以下影響因子的設(shè)計處理中,分別以某一因子為變
6、量,以對應(yīng)因子作對照,其它因子以上述轉(zhuǎn)化程序?yàn)闃?biāo)準(zhǔn),觀察各影響因子對轉(zhuǎn)化頻率的影響。所有實(shí)驗(yàn)處理均設(shè)3次重復(fù)。1.4.1預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)方式外植體在預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基上預(yù)培2d后進(jìn)行侵染轉(zhuǎn)化,設(shè)不預(yù)培養(yǎng)對照;共培養(yǎng)分光培和暗培兩種,觀察對轉(zhuǎn)化頻率的影響。1.4.2不同共培養(yǎng)基對轉(zhuǎn)化頻率的影響共培養(yǎng)培養(yǎng)基pH分別為5.2,5.4,5.8。1.4.3侵染時間和侵染方式分別設(shè)3,7,15min,真空侵染和搖動侵染觀察對轉(zhuǎn)化的影響。1.4.4卡那霉素篩選濃度確定初步篩選試驗(yàn):將子葉節(jié)接種到含卡那霉素濃度0,25,50,75,100mg·L-1的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)
7、基上進(jìn)行培養(yǎng),10d繼代1次,3周后統(tǒng)計分化結(jié)果。最終篩選濃度確定:以初步篩選結(jié)果較好的濃度為中心,設(shè)置第2次濃度梯度,共設(shè)為5個梯度,方法同上。3周后調(diào)查結(jié)果,以完全抑制子葉節(jié)分化為最佳的篩選濃度。1.5抗性植株的分子檢測1.5.1PCR檢測植物總DNA的提取用CTAB方法[3]。用特異性引物對植株進(jìn)行PCR擴(kuò)增。1.5.2PCR-Southern雜交分析用地高辛雜交試劑盒。取轉(zhuǎn)化植株基因組及非轉(zhuǎn)化基因組為陰性對照,陽性質(zhì)粒為陽性對照,用從質(zhì)粒上酶切下來的目的基因標(biāo)記探針,通過DNA電泳、轉(zhuǎn)膜、預(yù)雜交、雜交、顯色等步驟對抗性植株進(jìn)行檢測
8、。2結(jié)果與分析2.1預(yù)培養(yǎng)和不同共培養(yǎng)方式對轉(zhuǎn)化效率的影響在子葉節(jié)浸染農(nóng)桿菌之前預(yù)培養(yǎng)2d,芽再生頻率為36.5%,不進(jìn)行預(yù)培養(yǎng),直接用根癌農(nóng)桿菌感染的子葉再生綠芽頻率為19.7%(圖1)。表
