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1、用PrimerExpress軟件來(lái)設(shè)計(jì)比較方便、簡(jiǎn)單。網(wǎng)上搜索一下，我記得有網(wǎng)友提供的。如果實(shí)在找不到這個(gè)軟件的話(huà)，可以參考下面的指南。先設(shè)計(jì)好Probe，再設(shè)計(jì)Primer。goodluck。DesignGuidelinesEnsurethefollowingguidelinesaremet：????×Ampliconlength–50to150basesforoptimumPCRefficiency.????×??ProbeLength–13to30bases.Donotoverlapprimerandprobesequences.????×??Tm–68to70°C.????×??%GC
2、–30to80%.????×??5'end–CannotbeaGresidue.AGresidueadjacenttothereporterdyewillquenchthereporter????????fluorescencesomewhat,evenaftercleavage.Avoidthefollowingmotifs：????×??Repeatingoligonucleotides–Avoidrunsofidenticalnucleotides.Ifrepeatsarepresent,theremustbe????????fewerthanfourconsecutiveGresidu
3、es.????×??ConsecutiveAresidues–AvoidsixconsecutiveAresiduesanywhereintheprobe.ConsecutiveA????????residuescancauseahighNoTemplateControl(NTC)signal.????×??CCdinucleotides–AvoidtwoormoreCCdinucleotidesinthemiddleoftheprobe,whichcansometimes????????reducesignal.Selectadifferentprobeordesigntheprobeusi
4、ngtheanti-sense(complementary)strand.????×??FAM?dye-labeledprobes–IfyouwillorderaFAMdye-labeledprobe,avoidaGinthesecondpositiononthe5'end(VIC?dye-labeledprobesarenotaffected).AGinthesecondpositiononthe5'endinFAMdye-labeledprobescanreducefluorescentnormalizedreportersignal(Rn).??????×??HairpinLoops,s
5、elf-dimerization,andcross-dimerization.DesignConsiderationsWhenSelectingCandidateProbes：??????×??SelectprobeswithmoreCresiduesthanGresiduestominimizereporterfluorescencequenching.??????×??SelectprobeswithTm10°CormorehigherthantheprimerTm.定量PCRTaqman探針設(shè)計(jì)要領(lǐng)自90年代Taqman探針誕生以來(lái)，雖然熒光探針（引物）不斷有新的技術(shù)出現(xiàn)，但是作為一種經(jīng)
6、典的定量PCR技術(shù)，Taqman探針技術(shù)仍然是許多實(shí)驗(yàn)研究人員進(jìn)行定量檢測(cè)的首選，這主要是因?yàn)橄鄬?duì)于SYBR熒光染料，Taqman探針具有序列特異性，只結(jié)合到互補(bǔ)區(qū)，而且熒光信號(hào)與擴(kuò)增的拷貝數(shù)具有一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系，因此特異性強(qiáng)靈敏度高，而且條件優(yōu)化容易；而相對(duì)于雜交探針，Taqman探針只要設(shè)計(jì)一條探針，因此探針設(shè)計(jì)較便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。當(dāng)然Taqman定量方法由于還是要合成探針，也給實(shí)驗(yàn)操作帶來(lái)了挑戰(zhàn)。一般Taqman定量PCR實(shí)驗(yàn)過(guò)程為：目的基因查找比對(duì)→探針與引物設(shè)計(jì)→探針與引物合成→配置反應(yīng)體系→反應(yīng)參數(shù)→重復(fù)實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化條件→獲得曲線(xiàn)數(shù)據(jù)，比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)→再重復(fù)驗(yàn)證
7、?！〉谝徊剑涸诘谝徊侥康幕虿檎冶葘?duì)過(guò)程中可以利用NCBIgenbank序列以及DNAstar等軟件完成目的DNA或者RNA的查找與比對(duì)——這在分析測(cè)序報(bào)告的時(shí)候相信很多人操作過(guò)，這一步需要注意的就是要保證所分析的序列在一個(gè)contig（重疊群，即染色體的一些區(qū)域中毗鄰DNA片段重疊的情況）內(nèi)?！〉诙剑喝绻渌鼦l件一致，那么這個(gè)第二步——引物探針的設(shè)計(jì)就可以說(shuō)是定量PCR成敗的關(guān)鍵了，通過(guò)各方面
