Primer Express TaqMan引物探針設(shè)計.pdf

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1、PrimerExpressTaqMan引物探針設(shè)計一、安裝軟件ABI公司PrimerExpressv3.0PrimersandProbeDesignForReal-TimePCR二、Primers/ProbesDesignGuidelineTaqManProbePrimerProbe與Primer的距離愈近愈好,PCR產(chǎn)物大小建議在50-150bp為最佳G/C%為30-80%避免有重復(fù)序列的出現(xiàn)，尤其避免4個以上G的出現(xiàn)Tm值:68-70℃(Quantificationassay)Tm值:58-60℃65-67℃(AllelicDiscriminationassay)Probe

2、長:Primer長:13~25bases(TaqManMGBprobe)20bases(Optimal)13~30bases(TaqManprobe)避免連續(xù)6個A的序列出現(xiàn)3’端的前5個序列里不能超過2個C+G5’端第一個序列不能為G(如果選擇FAM-dye在5’端第二個序列也可以為G)b選擇C比G多的strand當(dāng)作probe避免3’端的前4個序列含有3個或以上Ga(GGG-MGB-3’orGGAG-MGB-3’)a避免probe的中間區(qū)域含有2個或以上的CCdi-nucleotidesa.針對TaqManMGB探針b.參數(shù)可選擇設(shè)定三、Primers&Probes（Aut

3、omaticallyDesign）①進(jìn)入PrimerExpress3.0軟件File→New→選擇TaqManMGBQuantification或TaqManQuantification→OK②Tools→按AddDNAFile，尋找序列存取位置，按下Add，將序列檔案加入空白文件。亦可在Sequence的界面中使用Copy&Paste復(fù)制和粘貼或直接輸入序列。*PrimerExpressSoftware只能接受dan,txt,ab1,或abi的檔案格式，請事先將欲分析的序列存成純文字檔即可(若序列是從databasedownload下來時,請刪除與序列無關(guān)的資料)。③可勾選D

4、oubleStrand,即會顯示doublestrandedDNAsequence。④各Tools選項(xiàng)操作1.Exclude:不必要的序列可利用ExcludeSelectedBases將序列劃掉。-先選取不要的序列范圍，點(diǎn)選“Exclude”，即可看見此區(qū)域被劃掉。2.Junction:如果已經(jīng)知道序列上junction位置則可利用Junction-選取juction的位置(必須含2bases)，再點(diǎn)選Junction，即可看見此區(qū)域被紅色標(biāo)記起來。3.在Parameters界面中可看到Primer/ProbeTm值設(shè)定及其他Primers/Probe情況。4.回到Sequen

5、ce界面，Tools→FindPrimers/Probes，軟件即開始找尋找適當(dāng)?shù)腜rimers/Probepairs。*PrimerExpress軟件會找到CandidatePrimers&Probepairs，一次search最多能找到50種組合，這些組合列與Primers/Probes界面中。中間Location說明primers&probes在序列中的相對位置，在橫線上方的數(shù)字代表起始位置，橫線下方則代表終止位置。⑤Sequence界面中會顯示出與Primers/Probes界面相對應(yīng)的一對Primers/Probe:粉紅色片段是Probe的位置，藍(lán)色代表Forward

6、Primer，黃色片段則為ReversePrimer，如下圖所示。(*但并不表示此為最佳的設(shè)計)。⑥在Primers/Probes界面中會將每對Primers/Probe的組合列出來，請從中挑選出適當(dāng)?shù)慕M合，挑選方式可依據(jù)之前的primer/probedesignguideline。在MGBProbe的篩選中,亦在Parameters界面中加選C比G多的序列作為進(jìn)一步篩選的參數(shù)。⑦決定primer/probeset之后則可進(jìn)行存檔，存檔的方式從File→SaveAs存檔。如果想將所選擇的primer/probeset單獨(dú)儲存,可利用Export→OrderInfo…的方式，或者

7、要儲存50個Primers/Probes清單，可點(diǎn)選Export→Primers/ProbesList…，以上兩種方式都可存成txt檔案，在Excel中開啟。