兩種定量分析方法的比較及taqman探針引物設計原則

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1、兩種定量分析方法的比較及Taqman探針、引物設計原則遺傳物質DNA首先要把所攜帶的遺傳信息轉錄成為信使RNA（mRNA）,攜帶遺傳信息的mRNA從細胞核進入到細胞質中與核糖體結合，在核糖體中mRNA攜帶的遺傳信息被翻譯成為多肽，多肽經(jīng)過進一步加工后變成蛋白質，至此遺傳物質DNA完成了表達過程。期間的轉錄過程是基因表達中非常重要的調節(jié)步驟，所轉錄的mRNA的多少直接影響著相關最終蛋白質的多少，所以通過對細胞內某條基因mRNA含量多少的分析，就能大致判斷出該條基因的表達是否活躍。定量PCR儀是在普通PCR儀的基礎上加裝了熒光激發(fā)裝置和熒光檢測裝置，PCR擴增和檢測同時進行；在PCR反應體系中

2、加入熒光基團，利用熒光信號的積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析。該技術于1996年由美國AppliedBiosystems公司推出，由于該技術不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前已得到廣泛應用。定量PCR常用的三個常用概念擴增曲線、熒光閾值、Ct值擴增曲線：反映PCR循環(huán)次數(shù)和熒光強度的曲線，定量PCR儀每次輪PCR擴增都會自動記錄熒光強度的變化熒光閾值：樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值，手動設置的原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光最高值，同時要盡量選擇進入指數(shù)

3、期的最初階段，并且保證回歸系數(shù)大于0.99。CT值：PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)。C(t)value擴增曲線閾值及CT值熒光定量PCR的數(shù)學原理理想的PCR反應：X=X0*2n非理想的PCR反應：X=X0*(1+Ex)n（n：擴增反應的循環(huán)次數(shù)；X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量；X0：初始模板量；Ex：擴增效率）在擴增產(chǎn)物達到閾值線時:XCt=X0(1+Ex)Ct=M(1)XCt:熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產(chǎn)物的量，在閾值線設定以后,它是一個常數(shù),我們設為M方程式(1)兩邊同時取對數(shù)得:logM=logX0(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:l

4、ogX0=-log(1+Ex)*Ct+logM(3)由此可見，logX0濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關系，根據(jù)樣品擴增達到域值的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計算出樣品中所含的該基因的初始模板量。Sample利用相對定量的方法分析目的基因的表達研究基因表達的情況，我們只需搞清楚該基因在不同生理階段的變化趨勢如何就行了，而無需知道該基因的絕對量有多少。基因表達調控研究中，由于RNA純化后得率不同、RNA反轉錄為cDNA的效率不同等客觀因素，用于定量分析的初始樣品濃度不同，這就造成了比較上的混亂，因此在進行基因表達調控研究中都會用一些看家基因來標準化，以校正因樣品初始濃度不同而造成的差異。所謂的看家基因即內參基因，

5、是指在各生理階段表達量恒定的基因，也稱奢侈基因，該基因表達一般不隨外界的變化而變化，所以常被用作參照，常用的內參基因有GAPDH基因、β-Actin基因，18srRNA基因等。因此，在做基因表達調控分析時至少要做兩個基因，目的基因和一個看家基因。假定在1生理時期，X基因的表達量為X1；其內參基因表達量為Y1；X1/Y1就將1生理時期的取樣、RNA提取、純化、反轉錄等過程的所有偏差均一化了；同樣在2生理時期，X2/Y2就將2生理時期的取樣、RNA提取、純化、反轉錄等過程的所有偏差均一化了；最后（X1/Y1）/（X2/Y2），所得的值就能就能較為真實的反應在1、2生理時期，X基因的變化情況。常

6、用的相對定量方法主要有兩種，雙標準曲線法和Delta-deltaCt法。一、雙標準曲線法所謂的雙標準曲線法就是對內參基因和所研究的目的基因都做絕對定量，然后將各生理階段的目的基因的量和內參基因的量相除，得出一個比值；最后再將不同生理階段所得的比值相除，最終得出目的基因在不同生理階段的表達變化。公式如下：雙標準曲線法的特點：1、考慮到了不同基因擴增效率的差異，用標準曲線來校正擴增效率，最大限度的避免了誤差；2、思路直觀、條理清晰、應用簡便，無需像Delta-deltaCT法那樣對實驗進行嚴格的優(yōu)化；3、其不足之處是每次實驗都必需對目的基因和看家基因做標準曲線；4、該方法適合樣品量大，但是所分

7、析目的基因較少的實驗。二、2-△△CT法公式如下：1、2-△△CT方法的推導PCR指數(shù)擴增的公式是：Xn是第n個循環(huán)后目標分子數(shù)；X0是初始目標分子數(shù)；Ex是目標分子擴增效率；n是循環(huán)數(shù)；CT代表目標擴增產(chǎn)物達到設定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)因此：XT是目標分子達到設定的閾值時的分子數(shù)；CT,X是目標分子擴增達到閾值時的循環(huán)數(shù)；Kx是一個常數(shù)；對于內參反應而言，也有同樣的公式：用XT除以RT得到：對于使用Taqman探針的實時擴