實時熒光taqman 探針設(shè)計

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1、一、實時熒光Taqman探針設(shè)計總原則：探針選擇要保守，引物選擇要保守，因此必須找一段100-200bp相對要保守的片段來設(shè)計引物與探針。即real-timePCR的擴增片段是50bp----150bp。當找不到150bp的保守片段時，必須確保探針的片段是保守的。在設(shè)計探針和引物時，要同時考慮在兩條鏈上設(shè)計引物與探針。但要注意的是：在那條鏈上設(shè)計探針時，就應(yīng)靠近在同一條鏈上設(shè)計的引物(即上游引物)。這樣，可保證在將來擴增時，即便沒有完全擴增，也有熒光信號報告出來。兩者的距離最好是探針的5’端離上游引物的3’有一個堿基，但也可以重疊。若在

2、原序列中找不到合適的探針與引物(1主要是探針和上游引物的距離太遠，而離下游引物的距離卻較近時；2突變位點要求在探針的5’端也能檢測到熒光信號，但卻是在3’端)，可在互補的序列中設(shè)計引物與探針。另real-timePCR中的探針和引物的Tm值，均要高于平常PCR的引物和雜交的探針的Tm值。二、探針的設(shè)計探針設(shè)計的基本原則：1．保守：探針要絕對的保守，有時分型就單獨依靠探針來決定。理論上有一個堿基不配對，就可能檢測不出來。若找不到完全保守的片段，也只能選取有一個堿基不同的片段。且這個不同的堿基最好在探針的中間，對探針與目的片段的雜交影響不大

3、，不相同的堿基最好不要在兩端，因為兩端不利于探針的雜交。且最好為A或T，而不能為G或A，因為A、T為雙鍵，而G、A為三鍵。2．探針長度Taqman探針的長度最好在25-32bp之間，且Tm值在68-72℃之間，最好為70℃，確保探針的Tm值要比引物的Tm值高出10℃，這樣可保證探針在煺火時先于引物與目的片段結(jié)合。因此探針最好是富含GC的保守片段，保證其的Tm值較高?，F(xiàn)在有TaqmanMGB探針，在TAMER之后再標記一個MGB，可使探針的Tm值較高,即使探針片段較短，也可達到Taqman探針的Tm值要求(68-70℃)。3．探針的名稱應(yīng)

4、標記探針在基因組的位置及長度。4．探針Tm值計算用oligo或primerpreiemer軟件即可計算Tm值。確保探針中GC含量在30-80%。應(yīng)避免探針中多個重復(fù)的堿基出現(xiàn)，尤其是要避免4個或超過4個的G堿基出現(xiàn)。5．探針的評價用DNAstar軟件中的Primerselect軟件，點擊“l(fā)og”菜單中的“createprimercatalog”，在“name”中輸入探針的名稱、位置，按Tab鍵進入“sequence”，粘貼或輸入要分析的探針序列。選中整個序列后，在“report”菜單下“primerselfdimer”,分析探針的二聚

5、體。彈出的窗口中就告訴此探針有多少個dimer，并對此探針用dG值進行評價(通常給出最差的dG值，理論上是dG值越大越好)。在“report”菜單下“primerhairpins”,分析探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。彈出的窗口中就告訴此探針有多少個hairpins，并對此探針的hairpins進行評價。多重熒光PCR時，要對多條探針進行“pairdimer”進行分析。6．探針的5’端不能為G，因為即使單個G堿基與FAM熒光報告基團相連時，G可以淬滅FAM基團所發(fā)出的熒光信號，從而導(dǎo)致假陰性的出現(xiàn)。7．Taqman探針與引物之間的位置Taqman探針應(yīng)

6、靠近上游引物，即Taqman探針應(yīng)靠近與其在同一條鏈上的上游引物。兩者的距離最好是探針的5’端離上游引物的3’有一個堿基，但也可以重疊，要保證Taqman探針的5’端離上游引物的5’端至少有4bp。如：forwardprimerTaqmanprobe5’→3’5’FAM→3’染料NNNNNNNNNNNNNN發(fā)表序列：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’互補發(fā)表序列3’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5’NNNNNNN3’←5’reverseprimer或

7、：reverseprimer5’→3’NNNNNNN發(fā)表序列：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’互補發(fā)表序列3’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5’NNNNNNNNNNNNNN料染3’←MAF5’3’←5’TaqmanprobeforwardprimerTaqmanprobeforwardprimer三引物的設(shè)計1．上下游引物要保守為了能夠擴增出所需要的保守片段，必須對保守的100-200片段進行PCR擴增。所以引物的選取也要非常的保守，最好不要有不同

8、的堿基，若不得不有時，也必須保證引物的3’端至少有4個堿基是完全保守才可。在設(shè)計保守引物時，要在發(fā)表序列上分別找保守一致的區(qū)域，即在發(fā)表序列的5’端引物位置找的是3’端至少有5個bp保守，在即在發(fā)表序列的3