分子信標(biāo)-taqman探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量pcr新型探針及-生物技術(shù)通報(bào)

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1、生物技術(shù)通報(bào)·技術(shù)與方法·BIOTECHNOLOGYBULLETIN2016,32(11):107-114分子信標(biāo)-TaqMan探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量PCR新型探針及引物1,32211,3姜文燦?岳素文?江洪?葛素君?王成彬(1.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院臨檢科,北京100853;2.北京泰格瑞分子檢驗(yàn)有限公司,北京100085;3.溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,溫州325000)摘要:在TaqMan探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量PCR中,排除由引物探針聚合延伸引起的假陽(yáng)性問(wèn)題以及由引物二聚體(PrimerDimer,PD)引起的假陰性問(wèn)題。首先對(duì)不同探針進(jìn)行引物探針聚合實(shí)驗(yàn);然

2、后通過(guò)雙重PCR的干擾實(shí)驗(yàn)選擇合適的內(nèi)標(biāo)基因,并使用內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒檢測(cè)驗(yàn)證中部同序引物排除PD干擾的實(shí)用性;最后比較探針?lè)ú煌w系檢測(cè)HBV基因的靈敏度。結(jié)果表明,引物與探針聚合實(shí)驗(yàn)中,含有反義堿基的HBVP4在重復(fù)實(shí)驗(yàn)中未出現(xiàn)假陽(yáng)性;競(jìng)爭(zhēng)性雙重PCR和非競(jìng)爭(zhēng)性雙重PCR兩模板開(kāi)始出-9-8現(xiàn)干擾作用的濃度差分別為20倍和100倍;對(duì)于內(nèi)標(biāo)基因,使用中部同序引物對(duì)以及普通引物對(duì)分別可以檢測(cè)到10和10稀釋度;3種HBV基因檢測(cè)體系,使用普通引物對(duì)可以檢測(cè)到Ct33左右,加入內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)和使用中部同序引物對(duì)均可檢測(cè)到Ct35左右。在TaqMan-分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)調(diào)整的基礎(chǔ)上引入反

3、義堿基可以在排除由引物和探針聚合延伸引起的假陽(yáng)性問(wèn)題;在探針?lè)ㄖ校褂弥胁客蛞飳?duì)和加入內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)均可降低PD的干擾程度,提升檢測(cè)的靈敏度。關(guān)鍵詞:實(shí)時(shí)熒光定量PCR;TaqMan探針;反義堿基;引物二聚體;內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)DOI:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.029NewProbeandPrimerforMolecularBeacon-TaqManRealTimeFluorescentQuantitativePCR1,32211,3JIANGWen-canYUESu-wenJIANGHongGESu-junWANGC

4、heng-bin(1.DepartmentofClinicalLaboratoryMedicine,ChinesePeople’sLiberationArmyGeneralHospital&PostgraduateMedicalSchool,Beijing100853;2.BeijingTagArrayMolecularTestCo.,Ltd,Beijing100085;3.CollegeofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000)Abstract:Ourpur

5、poseistoeliminatethefalsepositiveproblemcausedbyprimer-probeaggregationandextension,aswellasthefalsenegativeproblemcausedbyprimerdimer(PD).First,theprimerandprobeaggregationresultsweretestedfordifferentprobes;thentheappropriateinternalcontrolgene(IC)wasselectedbasedonthecompetitiveint

6、erferenceexperimentsofduplexPCR,simultaneously,thepracticabilityofcentral-homeprimerexcludingtheinferenceofPDwasverifiedontheplasmidoftheIC;andfinally,thesensitivitiesofdifferentsystemsforTaqManmethodwerecompared.TheprobeHBVP4,containinganantisensebase,didnotproducefalsepositiveresult

7、sintherepeatedtrials;theconcentrationdifferenceatwhichinterferencesforthetemplatesofcompetitiveandnon-competitiveduplexPCR-9werenoticedwas20timesand100times,respectively.Thedilutionthatcoulddetectedbycentral-homeprimerandcommonprimerwas10-8and10,respectively.Andfor3HBVgenedetectionsys

8、tems,

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