實時熒光定量 原理 taqman 探針簡介

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1、實時熒光定量PCR技術(shù)原理與應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)可對特定核苷酸片斷進行指數(shù)級的擴增。在擴增反應(yīng)結(jié)束之后，我們可以通過凝膠電泳的方法對擴增產(chǎn)物進行定性的分析，也可以通過放射性核素摻入標(biāo)記后的光密度掃描來進行定量的分析。無論定性還是定量分析，分析的都是PCR終產(chǎn)物。但是在許多情況下，我們所感興趣的是未經(jīng)PCR信號放大之前的起始模板量。例如我們想知道某一轉(zhuǎn)基因動植物轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)或者某一特定基因在特定組織中的表達量。在這種需求下熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)運而生。所謂的實時熒光定量PCR就是通過對PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測從而實現(xiàn)對起始

2、模板定量及定性的分析。在實時熒光定量PCR反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖(如圖1)。圖1實時熒光擴增曲線圖一般而言，熒光擴增曲線擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，我們無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加。PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，

3、所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計算出起始DNA拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便，在實時熒光定量PCR技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和CT值。熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值（thresholdvalue）（如圖2所示）。圖2.熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

4、CT值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，CT值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值（如圖3所示）。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。圖3閾值線和CT值熒光探針和熒光染料實時熒光定量PCR的化學(xué)原理包括探針類和非探針類兩種，探針類是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增產(chǎn)物的增加，非探針類則是利用熒光染料或者特殊設(shè)計的引物來指示擴增的增加。前者由于增加了探針的識別步驟，特異性更高，但后者則簡便易

5、行。TaqMan探針TaqMan探針是多人擁有的專利技術(shù)。TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，它的熒光與目的序列的擴增相關(guān)。它設(shè)計為與目標(biāo)序列上游引物和下游引物之間的序列配對。熒光基團連接在探針的5’末端，而淬滅劑則在3’末端。當(dāng)完整的探針與目標(biāo)序列配對時，熒光基團發(fā)射的熒光因與3’端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進行延伸反應(yīng)時，聚合酶的5’外切酶活性將探針進行酶切，使得熒光基團與淬滅劑分離。TaqMan探針適合于各種耐熱的聚合酶，如DyNAzymeTMIIDNA聚合酶（MJResearch公司有售）。隨著擴增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來的熒光基團不斷積累。因此

6、熒光強度與擴增產(chǎn)物的數(shù)量呈正比關(guān)系。