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《Taqman探針及SYBR Green I熒光染料技術.ppt》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在工程資料-天天文庫。
1、半定量RT-PCR原理半定量RT-PCR是指通過總RNA逆轉錄為cDNA后，擴增目標cDNA和內參cDNA，通過PCR產(chǎn)物量推測樣品中特異mRNA的相對數(shù)量。內參是基因組中保守的DNA序列，其表達恒定，因此在總RNA中所占的比例是大致恒定的。目標基因在受到處理因素影響后，其表達量一般有所改變。這樣擴增后目標產(chǎn)物與內參產(chǎn)物量的比會有所變化，可以說明目標基因的表達量的改變，做到半定量！內參一般選用如：β-actin（β肌動蛋白），GAPDH（三磷酸甘油醛脫氫酶）等步驟：1.抽提RNA，2.反轉錄獲得cDNA，3.以cDNA為模板做PCR注意
2、：步驟1，RNA抽提質量一定要好，注意污染。內參的選擇，常用的有βactin和GAPDH兩種。步驟3，半定量RT-PCR應該在兩管中進行，既內參和目的基因各一管，這樣便于控制，做圖的時候可以放在一各泳道里跑！指數(shù)期和平臺期一定要摸清楚！半定量RT-PCR步驟TaqMan探針法是高度特異的定量PCR技術，其核心是利用Taq酶的5′→3′外切核酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號。由于探針與模板是特異性結合，所以熒光信號的強弱就代表了模板的數(shù)量。 在TaqMan探針法的定量PCR反應體系中，包括一對PCR引物和一條探針。探針只與模板特異性地結合
3、，其結合位點在兩條引物之間。探針的5′端標記有報告基團(Reporter,R)，如FAM、VIC等，3′端標記有熒光淬滅基團(Quencher,Q)，如TAMRA等。當探針完整的時候，報告基團所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團吸收，儀器檢測不到信號。隨著PCR的進行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結合的探針，其3′→5′外切核酸酶活性就會將探針切斷，報告基團遠離淬滅基團，其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號（圖4）。所以，每經(jīng)過一個PCR循環(huán)，熒光信號也和目的片段一樣，有一個同步指數(shù)增長的過程。信號的強度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)。TaqMan探
4、針法TaqMan探針法TaqMan探針根據(jù)其3′端標記的熒光淬滅基團的不同分為兩種：普通的TaqMan探針和TaqManMGB探針。MGB探針的淬滅基團采用非熒光淬滅基團(Non-FluorescentQuencher)，本身不產(chǎn)生熒光，可以大大降低本底信號的強度。同時探針上還連接有MGB(MinorGrooveBinder)修飾基團（圖5），可以將探針的Tm值提高10°C左右。因此為了獲得同樣的Tm值，MGB探針可以比普通TaqMan探針設計得更短，既降低了合成成本，也使得探針設計的成功率大為提高。因為在模板的DNA堿基組成不理想的情
5、況下，短的探針比長的更容易設計。實驗證明，TaqManMGB探針對于富含A/T的模板可以區(qū)分得更為理想。TaqMan探針法TaqMan探針法SYBRGreenI熒光染料技術原理SYBRGreenI是一種只與DNA雙鏈結合的熒光染料（圖6）。當它與DNA雙鏈結合時，發(fā)出熒光；從DNA雙鏈上釋放出來時，熒光信號急劇減弱。因此，在一個體系內，其信號強度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。SYBRGreen熒光染料法定量PCR的基本過程是：1、開始反應，當SYBRGreen染料與DNA雙鏈結合時發(fā)出熒光。2、DNA變性時，SYBRGreen染料釋放出來
6、，熒光急劇減少。3、在聚合延伸過程中，引物退火并形成PCR產(chǎn)物。4、聚合完成后，SYBRGreen染料與雙鏈產(chǎn)物結合，定量PCR系統(tǒng)檢測到熒光的凈增量加大。SYBRGreenI熒光染料技術SYBRGreenI熒光染料技術SYBRGreenI熒光染料能與所有的DNA雙鏈相結合，對DNA模板沒有選擇性，所以特異性不如TaqMan探針。要想用熒光染料法得到比較好的定量結果，對PCR引物設計的特異性和PCR反應的質量要求就比較高。在此前提下，本法是一種成本低廉的選擇。常規(guī)PCR儀實時定量PCR儀
