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《Taqman探針設計要領》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在教育資源-天天文庫。
1、定量——絕對標準曲線方法標準品：純化的質粒dsDNA，體外轉錄的RNA準確配制標準系列并且注意其穩(wěn)定性，最好分裝后保存于-80℃熒光材料：雜交探針、水解探針或SYBRGreenI不可以使用DNA作為標準品對RNA進行定量應用于定量病毒荷載量等定量——相對標準曲線方法指在測定目的基因的同時測定某一內對照基因，用一系列已知外參物做標準曲線，根據(jù)該標準曲線得到目的基因和內對照基因的量，再將目的基因的同內對照基因的比值作為定量的最后結果標準品：含有目標基因的DNA或RNA一般選用看家基因校正常選擇看家基因GAPDH、β-actin、rRNA在假設樣品逆轉錄效率相同的前提下，可以使用DNA的標準曲線
2、對RNA進行定量較常用的一種方法比較Ct法假設目的基因與看家基因擴增效率相同，數(shù)學推導得出目的基因的量=2-ΔΔCtΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對照2-ΔΔCt表示的是實驗組目的基因的表達相對于對照組的變化倍數(shù)在目的基因與看家基因擴增效率相同的情況下可以直接得到的目的基因相對于管家基因的定量，而不必制作標準曲線更為簡便省時，也是相當可靠的重復性問題判斷實驗結果優(yōu)劣的重要指標主要判斷指標為標準差（SD）和變異系數(shù)（CV）影響結果重復性的因素PCR反應擴增的效率優(yōu)化實驗條件，使反應體系達到最佳擴增效率目的基因的初始濃度使用初始濃度具有較高數(shù)量級
3、的樣本或作平行孔標準曲線的影響5個稀釋度的標準品，涵蓋待測樣本中目的基因量可能出現(xiàn)的全部濃度范圍理想的標準品應與樣本具有高同源性：質粒DNA或是體外合成、轉錄的RNA影響敏感度的因素反應體系中形成的引物二聚體的影響可以用水解探針代替SYBRGreenI，有文獻報導使用水解探針的敏感性要比SYBRGreenI高出10倍?？梢允褂脽釂愚k法或使用特殊處理的Taq酶要盡可能地優(yōu)化引物設計如果反應體系中出現(xiàn)PCR的抑制因素，應適當將目的基因的濃度稀釋后再進行擴增。注意避免室溫混合各種試劑，并且在一經(jīng)混合后立即開始進行擴增。循環(huán)數(shù)Mg2＋的濃度應用對各種基因表達進行定量分析基礎研究：不同組織、用藥前
4、后、不同發(fā)育階段基因表達差異的檢測臨床：細菌、病毒、寄生蟲等病原體的檢測DNA、mRNA病毒荷載量的定量腫瘤相關基因、腫瘤標志物和腫瘤耐藥基因的檢測食品衛(wèi)生檢疫：轉基因食品瘟疫流行地區(qū)進口的食品點突變分析和等位基因分析單核苷酸多態(tài)性（SNP）分析DNA甲基化檢測如何設計熒光定量PCR實驗方案根據(jù)擬要研究的基因名稱，在genebank中找到相應的基因序列（www.ncbi.nlm.nih.gov）采用引物設計軟件PrimerExpress2.0(Taqman探針或SYBRGreenI，說明見www.appliedbiosystems.com/support/apptech)和beaconde
5、signs3.0進行引物探針的設計軟件可在www.shinegene.org.cn下載PCR產(chǎn)物大小在50-150bpTaqMan探針設計原則保持G-C含量在30-80%之間避免同一堿基重復過多。特別是G，不可超過4個及以上5’不能是G盡量使探針中的C多于G上述兩條如果不能滿足，則使用互補鏈上的探針對于單探針反應，用PrimerExpress軟件計算出來的Tm值應當在68-70℃之間，比引物高10℃。長度<30bp引物設計原則在探針確定以后再選擇引物引物要盡可能地接近探針，但是不要重疊保持G-C含量在30-80%之間避免同一堿基重復過多。特別是G，不可超過4個及以上用PrimerExpre
6、ss軟件計算出來的Tm值應當在58-60℃之間3’的5個堿基中G和/或C堿基的總數(shù)不能超過2個引物和探針的設計原則的重要程度由上往下越來越低如果是設計SYBRGreenI引物，也要選擇TaqManPrimerandProbedesign并遵守這些規(guī)則，但是只需要合成引物就可以了。為了確保引物和探針的特異性，最好將設計好的序列在www.ncbi.nlm.nih/blast中核實一次，如果發(fā)現(xiàn)由非特異性互補區(qū)，建議重新設計引物探針。如何設計熒光定量PCR實驗方案根據(jù)儀器和個人的喜好，確定熒光定量PCR的方法，選擇熒光素的種類合成引物和探針收集樣品、提取RNA或DNA（-80℃保存，避免反復凍融
7、）制備標準品（質粒、化學合成的目的基因）拷貝數(shù)=質量÷分子量×6.0×1023標準曲線通常由4～5個點組成配制好的引物和探針，保存于-20℃，注意避光保存探針RT反應如何設計熒光定量PCR實驗方案不加探針的常規(guī)PCR反應，驗證引物是否合適、模板是否降解、模板純度是否合適。同時確定最佳反應體系和反應條件每次實驗都設置陰性對照和標準品，每個樣品設兩個平行孔
