mtx壓力與表達(dá)篩選

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1、MSX加壓篩選與MTX加壓篩選分子生物與細(xì)胞培養(yǎng)蛋氨酸亞氨基代砜(methioninesulfoximine,MSX)篩選用的是谷氨酰胺合成酶基因（glutaminesynthetase,GS）系統(tǒng)壓力；?氨甲喋呤（amethopterin,MTX）篩選用的是二氫葉酸還原酶基因（dihydrofolatereductase,dhfr）系統(tǒng)壓力。?1.CHO細(xì)胞表達(dá)體系????常用的CHO細(xì)胞系有兩種：CHO和CHO(dhfr-)，CHO(dhfr-)是缺失二氫葉酸還原酶的細(xì)胞株。CHO表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的真核表達(dá)系統(tǒng)之一，與其它表達(dá)

2、系統(tǒng)相比，它具有許多優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能，表達(dá)的糖基化藥物蛋白在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近天然蛋白分子；表達(dá)產(chǎn)物胞外分泌，便于分離純化；具有重組基因的高效擴(kuò)增和表達(dá)能力；貼壁生長(zhǎng)，有較高的耐受剪切力和滲透壓能力，可進(jìn)行懸浮培養(yǎng)或在無(wú)血清培養(yǎng)基中達(dá)到高密度，培養(yǎng)體積能達(dá)到1000L以上；CHO細(xì)胞屬于成纖維細(xì)胞，很少分泌內(nèi)源蛋白，利于外源蛋白的分離純化。改造CHO細(xì)胞，可更好地表達(dá)外源蛋白。為減少大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中凋亡的發(fā)生，將bcl-2基因（細(xì)胞凋亡抑制基因）導(dǎo)入細(xì)胞，bcl-2基因的過(guò)量表達(dá)能抑制Gln或氧缺乏引起

3、的細(xì)胞凋亡，減少細(xì)胞特定營(yíng)養(yǎng)成分的消耗，提高細(xì)胞密度和目的蛋白產(chǎn)量。向CHO細(xì)胞中導(dǎo)入p21、p27基因，可使細(xì)胞G1期延長(zhǎng)（細(xì)胞靜止），改造后細(xì)胞活力正常，營(yíng)養(yǎng)成分消耗和代謝毒物含量有效降低，從而減少細(xì)胞凋亡、死亡，外源蛋白表達(dá)量提高，產(chǎn)品成本降低。2.載體系統(tǒng)????借助真核基因表達(dá)調(diào)控的理論，可將較強(qiáng)的順式作用元件集中到一個(gè)載體中，使其方便高效地表達(dá)外源基因。目前，已經(jīng)構(gòu)建了許多真核表達(dá)載體，它們包含適當(dāng)?shù)捻樖阶饔迷瓦x擇標(biāo)記。順式作用元件主要有啟動(dòng)子—增強(qiáng)子元件、轉(zhuǎn)錄剪切和PolyA信號(hào)等；CHO細(xì)胞表達(dá)載體中主要有兩類選擇標(biāo)記

4、：非擴(kuò)增基因和共擴(kuò)增基因。2.1啟動(dòng)子和增強(qiáng)子啟動(dòng)子是影響外源基因表達(dá)效率的關(guān)鍵因素。作為表達(dá)載體元件之一，啟動(dòng)子既需強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性，又應(yīng)具備較廣的應(yīng)用范圍。細(xì)菌的主要啟動(dòng)子和增強(qiáng)子在動(dòng)物細(xì)胞中不起作用，所以大多從啟動(dòng)效率高且生物背景清楚的病毒基因組中分離得到。SV40、LTR和CMV啟動(dòng)子在CHO細(xì)胞中效果良好。有研究表明：在CHO細(xì)胞中，CMV啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性分別是SV40啟動(dòng)子和LTR啟動(dòng)子的10倍和30倍左右。來(lái)源于噬菌體的一些啟動(dòng)子，如T7啟動(dòng)子也可用于動(dòng)物細(xì)胞。除了病毒來(lái)源的啟動(dòng)子，現(xiàn)在熱衷于尋找細(xì)胞內(nèi)源性的啟動(dòng)子，如肽鏈延長(zhǎng)因

5、子基因的啟動(dòng)子（EF-1α）、雞胞漿β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子等。EF-1α啟動(dòng)子是迄今應(yīng)用中最強(qiáng)的啟動(dòng)子之一。目前商業(yè)化的表達(dá)載體中主要使用SV40、CMV和EF-1α啟動(dòng)子。外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)受許多因素的影響，如轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后處理、翻譯水平以及翻譯后加工等方面，其中尤以轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)最為重要。在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是由基因的順式作用元件與細(xì)胞內(nèi)存在的反式作用因子之間的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)，由于在特定的細(xì)胞內(nèi)，反式作用因子是固定的，不可改變的，因此基因的表達(dá)主要取決于其順式作用元件的作用。對(duì)外源基因而言，也就是決定于特定的表達(dá)載體中的啟動(dòng)

6、子，一個(gè)合適的啟動(dòng)子可將外源基因的表達(dá)水平提高幾倍甚至幾十倍。但是對(duì)于特定的基因和細(xì)胞，各啟動(dòng)子起始轉(zhuǎn)錄的效率有很大的差別，因此我們認(rèn)為在進(jìn)行外源基因的表達(dá)研究中，應(yīng)考慮選用幾種不同的強(qiáng)啟動(dòng)子，才有可能獲得較為理想的表達(dá)效果。與啟動(dòng)子相連的是增強(qiáng)子元件，具種、組織特異性，CHO細(xì)胞中一般采用SV40和CMV增強(qiáng)子。2.2選擇標(biāo)記和基因擴(kuò)增CHO細(xì)胞表達(dá)載體主要有兩類選擇標(biāo)記。一類是neo等非擴(kuò)增基因，它對(duì)目的基因的拷貝數(shù)沒(méi)有影響，用于構(gòu)建瞬時(shí)表達(dá)載體。另一類具有基因擴(kuò)增的功能，也稱共擴(kuò)增基因，如二氫葉酸還原酶基因（dihydrofolat

7、ereductase，dhfr），谷氨酰胺合成酶基因（glutaminesynthetase，gs）。?外源基因在CHO細(xì)胞中擴(kuò)增是提高表達(dá)水平的重要策略之一。dhfr基因擴(kuò)增系統(tǒng)最常用，當(dāng)攜帶dhfr基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后，或攜帶dhfr基因的標(biāo)志質(zhì)粒與攜帶外源基因的表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CHO-dhfr-細(xì)胞后，可以得到在選擇培養(yǎng)基生長(zhǎng)的細(xì)胞克隆，dhfr可被葉酸類似物氨甲喋呤（Amethopterin，MTX）所抑制，不斷提高M(jìn)TX濃度，絕大多數(shù)細(xì)胞死亡，但在極少數(shù)幸存下來(lái)的抗性細(xì)胞中，dhfr基因均得以擴(kuò)增。進(jìn)行性選擇抗氨甲喋呤的

8、細(xì)胞系，結(jié)果會(huì)導(dǎo)致與dhfr串聯(lián)在一起的外源基因的共擴(kuò)增，拷貝數(shù)可增加幾百到幾千倍，從而使目的基因高水平表達(dá)，從而抵消氨甲喋呤的抑制效應(yīng)。更重要的是，擴(kuò)增的區(qū)域遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于dhfr基因本身，即與d