msx加壓篩選與mtx加壓篩選

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1、蛋氨酸亞氨基代砜(methioninesulfoximine,MSX)篩選用的是谷氨酰胺合成酶基因(glutaminesynthetase,GS)系統(tǒng)壓力;?氨甲喋呤(amethopterin,MTX)篩選用的是二氫葉酸還原酶基因(dihydrofolatereductase,dhfr)系統(tǒng)壓力。?1.CHO細胞表達體系????常用的CHO細胞系有兩種:CHO和CHO(dhfr-),CHO(dhfr-)是缺失二氫葉酸還原酶的細胞株。CHO表達系統(tǒng)是目前應用最廣泛的真核表達系統(tǒng)之一,與其它表達系統(tǒng)

2、相比,它具有許多優(yōu)點:準確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能,表達的糖基化藥物蛋白在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學功能方面最接近天然蛋白分子;表達產(chǎn)物胞外分泌,便于分離純化;具有重組基因的高效擴增和表達能力;貼壁生長,有較高的耐受剪切力和滲透壓能力,可進行懸浮培養(yǎng)或在無血清培養(yǎng)基中達到高密度,培養(yǎng)體積能達到1000L以上;CHO細胞屬于成纖維細胞,很少分泌內(nèi)源蛋白,利于外源蛋白的分離純化。改造CHO細胞,可更好地表達外源蛋白。為減少大規(guī)模細胞培養(yǎng)過程中凋亡的發(fā)生,將bcl-2基因(細胞凋亡抑制基因)導入細胞,bcl-

3、2基因的過量表達能抑制Gln或氧缺乏引起的細胞凋亡,減少細胞特定營養(yǎng)成分的消耗,提高細胞密度和目的蛋白產(chǎn)量。向CHO細胞中導入p21、p27基因,可使細胞G1期延長(細胞靜止),改造后細胞活力正常,營養(yǎng)成分消耗和代謝毒物含量有效降低,從而減少細胞凋亡、死亡,外源蛋白表達量提高,產(chǎn)品成本降低。2.載體系統(tǒng)????借助真核基因表達調(diào)控的理論,可將較強的順式作用元件集中到一個載體中,使其方便高效地表達外源基因。目前,已經(jīng)構(gòu)建了許多真核表達載體,它們包含適當?shù)捻樖阶饔迷瓦x擇標記。順式作用元件主要有啟

4、動子—增強子元件、轉(zhuǎn)錄剪切和PolyA信號等;CHO細胞表達載體中主要有兩類選擇標記:非擴增基因和共擴增基因。2.1啟動子和增強子啟動子是影響外源基因表達效率的關鍵因素。作為表達載體元件之一,啟動子既需強的轉(zhuǎn)錄活性,又應具備較廣的應用范圍。細菌的主要啟動子和增強子在動物細胞中不起作用,所以大多從啟動效率高且生物背景清楚的病毒基因組中分離得到。SV40、LTR和CMV啟動子在CHO細胞中效果良好。有研究表明:在CHO細胞中,CMV啟動子的轉(zhuǎn)錄活性分別是SV40啟動子和LTR啟動子的10倍和30倍左

5、右。來源于噬菌體的一些啟動子,如T7啟動子也可用于動物細胞。除了病毒來源的啟動子,現(xiàn)在熱衷于尋找細胞內(nèi)源性的啟動子,如肽鏈延長因子基因的啟動子(EF-1α)、雞胞漿β肌動蛋白啟動子等。EF-1α啟動子是迄今應用中最強的啟動子之一。目前商業(yè)化的表達載體中主要使用SV40、CMV和EF-1α啟動子。外源基因在哺乳動物細胞中的表達受許多因素的影響,如轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后處理、翻譯水平以及翻譯后加工等方面,其中尤以轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)最為重要。在細胞中轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是由基因的順式作用元件與細胞內(nèi)存在的反式作用因子

6、之間的相互作用來實現(xiàn),由于在特定的細胞內(nèi),反式作用因子是固定的,不可改變的,因此基因的表達主要取決于其順式作用元件的作用。對外源基因而言,也就是決定于特定的表達載體中的啟動子,一個合適的啟動子可將外源基因的表達水平提高幾倍甚至幾十倍。但是對于特定的基因和細胞,各啟動子起始轉(zhuǎn)錄的效率有很大的差別,因此我們認為在進行外源基因的表達研究中,應考慮選用幾種不同的強啟動子,才有可能獲得較為理想的表達效果。與啟動子相連的是增強子元件,具種、組織特異性,CHO細胞中一般采用SV40和CMV增強子。2.2選擇標

7、記和基因擴增CHO細胞表達載體主要有兩類選擇標記。一類是neo等非擴增基因,它對目的基因的拷貝數(shù)沒有影響,用于構(gòu)建瞬時表達載體。另一類具有基因擴增的功能,也稱共擴增基因,如二氫葉酸還原酶基因(dihydrofolatereductase,dhfr),谷氨酰胺合成酶基因(glutaminesynthetase,gs)。外源基因在CHO細胞中擴增是提高表達水平的重要策略之一。dhfr基因擴增系統(tǒng)最常用,當攜帶dhfr基因的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細胞后,或攜帶dhfr基因的標志質(zhì)粒與攜帶外源基因的表達質(zhì)粒

8、共轉(zhuǎn)染CHO-dhfr-細胞后,可以得到在選擇培養(yǎng)基生長的細胞克隆,dhfr可被葉酸類似物氨甲喋呤(Amethopterin,MTX)所抑制,不斷提高MTX濃度,絕大多數(shù)細胞死亡,但在極少數(shù)幸存下來的抗性細胞中,dhfr基因均得以擴增。進行性選擇抗氨甲喋呤的細胞系,結(jié)果會導致與dhfr串聯(lián)在一起的外源基因的共擴增,拷貝數(shù)可增加幾百到幾千倍,從而使目的基因高水平表達,從而抵消氨甲喋呤的抑制效應。更重要的是,擴增的區(qū)域遠遠大于dhfr基因本身,即與dhfr基因相鄰的DNA區(qū)域同時被擴增。但它也有缺陷

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