msx加壓篩選與mtx加壓篩選

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1、蛋氨酸亞氨基代砜(methioninesulfoximine,MSX)篩選用的是谷氨酰胺合成酶基因（glutaminesynthetase,GS）系統(tǒng)壓力；?氨甲喋呤（amethopterin,MTX）篩選用的是二氫葉酸還原酶基因（dihydrofolatereductase,dhfr）系統(tǒng)壓力。?1.CHO細胞表達體系????常用的CHO細胞系有兩種：CHO和CHO(dhfr-)，CHO(dhfr-)是缺失二氫葉酸還原酶的細胞株。CHO表達系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的真核表達系統(tǒng)之一，與其它表達系統(tǒng)

2、相比，它具有許多優(yōu)點：準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能，表達的糖基化藥物蛋白在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近天然蛋白分子；表達產(chǎn)物胞外分泌，便于分離純化；具有重組基因的高效擴增和表達能力；貼壁生長，有較高的耐受剪切力和滲透壓能力，可進行懸浮培養(yǎng)或在無血清培養(yǎng)基中達到高密度，培養(yǎng)體積能達到1000L以上；CHO細胞屬于成纖維細胞，很少分泌內(nèi)源蛋白，利于外源蛋白的分離純化。改造CHO細胞，可更好地表達外源蛋白。為減少大規(guī)模細胞培養(yǎng)過程中凋亡的發(fā)生，將bcl-2基因（細胞凋亡抑制基因）導(dǎo)入細胞，bcl-

3、2基因的過量表達能抑制Gln或氧缺乏引起的細胞凋亡，減少細胞特定營養(yǎng)成分的消耗，提高細胞密度和目的蛋白產(chǎn)量。向CHO細胞中導(dǎo)入p21、p27基因，可使細胞G1期延長（細胞靜止），改造后細胞活力正常，營養(yǎng)成分消耗和代謝毒物含量有效降低，從而減少細胞凋亡、死亡，外源蛋白表達量提高，產(chǎn)品成本降低。2.載體系統(tǒng)????借助真核基因表達調(diào)控的理論，可將較強的順式作用元件集中到一個載體中，使其方便高效地表達外源基因。目前，已經(jīng)構(gòu)建了許多真核表達載體，它們包含適當(dāng)?shù)捻樖阶饔迷瓦x擇標(biāo)記。順式作用元件主要有啟

4、動子—增強子元件、轉(zhuǎn)錄剪切和PolyA信號等；CHO細胞表達載體中主要有兩類選擇標(biāo)記：非擴增基因和共擴增基因。2.1啟動子和增強子啟動子是影響外源基因表達效率的關(guān)鍵因素。作為表達載體元件之一，啟動子既需強的轉(zhuǎn)錄活性，又應(yīng)具備較廣的應(yīng)用范圍。細菌的主要啟動子和增強子在動物細胞中不起作用，所以大多從啟動效率高且生物背景清楚的病毒基因組中分離得到。SV40、LTR和CMV啟動子在CHO細胞中效果良好。有研究表明：在CHO細胞中，CMV啟動子的轉(zhuǎn)錄活性分別是SV40啟動子和LTR啟動子的10倍和30倍左

5、右。來源于噬菌體的一些啟動子，如T7啟動子也可用于動物細胞。除了病毒來源的啟動子，現(xiàn)在熱衷于尋找細胞內(nèi)源性的啟動子，如肽鏈延長因子基因的啟動子（EF-1α）、雞胞漿β肌動蛋白啟動子等。EF-1α啟動子是迄今應(yīng)用中最強的啟動子之一。目前商業(yè)化的表達載體中主要使用SV40、CMV和EF-1α啟動子。外源基因在哺乳動物細胞中的表達受許多因素的影響，如轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后處理、翻譯水平以及翻譯后加工等方面，其中尤以轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)最為重要。在細胞中轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是由基因的順式作用元件與細胞內(nèi)存在的反式作用因子

6、之間的相互作用來實現(xiàn)，由于在特定的細胞內(nèi)，反式作用因子是固定的，不可改變的，因此基因的表達主要取決于其順式作用元件的作用。對外源基因而言，也就是決定于特定的表達載體中的啟動子，一個合適的啟動子可將外源基因的表達水平提高幾倍甚至幾十倍。但是對于特定的基因和細胞，各啟動子起始轉(zhuǎn)錄的效率有很大的差別，因此我們認為在進行外源基因的表達研究中，應(yīng)考慮選用幾種不同的強啟動子，才有可能獲得較為理想的表達效果。與啟動子相連的是增強子元件，具種、組織特異性，CHO細胞中一般采用SV40和CMV增強子。2.2選擇標(biāo)

7、記和基因擴增CHO細胞表達載體主要有兩類選擇標(biāo)記。一類是neo等非擴增基因，它對目的基因的拷貝數(shù)沒有影響，用于構(gòu)建瞬時表達載體。另一類具有基因擴增的功能，也稱共擴增基因，如二氫葉酸還原酶基因（dihydrofolatereductase，dhfr），谷氨酰胺合成酶基因（glutaminesynthetase，gs）。外源基因在CHO細胞中擴增是提高表達水平的重要策略之一。dhfr基因擴增系統(tǒng)最常用，當(dāng)攜帶dhfr基因的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細胞后，或攜帶dhfr基因的標(biāo)志質(zhì)粒與攜帶外源基因的表達質(zhì)粒

8、共轉(zhuǎn)染CHO-dhfr-細胞后，可以得到在選擇培養(yǎng)基生長的細胞克隆，dhfr可被葉酸類似物氨甲喋呤（Amethopterin，MTX）所抑制，不斷提高MTX濃度，絕大多數(shù)細胞死亡，但在極少數(shù)幸存下來的抗性細胞中，dhfr基因均得以擴增。進行性選擇抗氨甲喋呤的細胞系，結(jié)果會導(dǎo)致與dhfr串聯(lián)在一起的外源基因的共擴增，拷貝數(shù)可增加幾百到幾千倍，從而使目的基因高水平表達，從而抵消氨甲喋呤的抑制效應(yīng)。更重要的是，擴增的區(qū)域遠遠大于dhfr基因本身，即與dhfr基因相鄰的DNA區(qū)域同時被擴增。但它也有缺陷