羊軟骨ⅱ型膠原蛋白的提取純化與鑒定

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1、羊軟骨Ⅱ型膠原蛋白的提取純化與鑒定：肖旭，石文達(dá)，姚青，陳虎，王基云，李曉兵，高嶺【摘要】目的從羊肋軟骨中提取純化Ⅱ型膠原蛋白，并對其進(jìn)行鑒定。方法選擇羊肋軟骨為原料經(jīng)脫脂、脫鈣后，用鹽酸胍去除蛋白多糖，經(jīng)胃蛋白酶消化、氯化鈉鹽析等步驟，提取純化蛋白，然后進(jìn)行鑒定。結(jié)果4mol/L鹽酸胍能有效去除蛋白多糖，用胃蛋白酶的限制性酶解結(jié)果滿意；氯化鈉鹽析濃度為3mol/L時(shí)最佳。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示提取純化的蛋白與Sigma公司的Ⅱ型膠原蛋白一致。Ⅱ型膠原蛋白最大吸收峰為212nm。結(jié)論從羊肋軟骨提取的Ⅱ型膠原蛋白純度高，且符合II型

2、膠原蛋白的特征。【關(guān)鍵詞】Ⅱ型膠原蛋白；軟骨；蛋白多糖　　Abstract:ObjectiveToisolateandpurifycollagentypeⅡ(CⅡ)fromSheepcartilageandtoidentifyitspurity.MethodsTheSheepcartilagesaterials.Afterdegreasinganddecalcification,Guanidinehydrochlorideovetheproteoglycans.Thedigestionofpepsin,saltingofsodiumch

3、lorideedforextractingCⅡandidentification.ResultsTheproteoglycanscouldbeefficientlyremovedby4mol?L1guanidinehydrochloride.Theresultsitedenzymedigestionofpepsinadded.TheoptimizingconcentrationofsodiumchlorideforsaltingCⅡol?L1.ItaCⅡelocationbySDSPAGE.Theabsorptionpeak.Co

4、nclusionTheCⅡisolatedfromSheepcartilagehashighpurityandaccordsatoidArthritis，RA)有顯著的療效［4］。對于膠原蛋白的提取目前所報(bào)道的方法，操作復(fù)雜，條件不一，結(jié)果存在很大的差別［5-8］。本研究選擇寧夏富有的綿羯羊肋軟骨為原料，來制備較高純度的Ⅱ型膠原，報(bào)告如下。　　1實(shí)驗(yàn)材料和方法　　1.1主要試劑和耗材胃蛋白酶(Amresco公司)；鹽酸胍（Amresco公司）；牛Ⅱ型膠原蛋白參照品(C7806Sigma公司)；46～200kD蛋白質(zhì)分子量標(biāo)志物(寶生物工

5、程有限公司)，陰離子交換載體(DEAE32上海試劑二廠)，透析袋（德國SercaFeinbiochemica公司），余試劑均為國產(chǎn)分析純。　　1.2主要儀器電泳儀(Bio-Rad公司)；凝膠全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)(Bio-Ra公司)；冷凍離心機(jī)(日立公司CF16RX)；酸度計(jì)(梅特勒-托利多儀器有限公司)；電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；721分光光度計(jì)(Varian公司)；LL-3000型冷凍干燥機(jī)（ThermoElectronCorporation）?！　?.3方法　　1.3.1膠原蛋白的提取　　從新鮮的羊肋軟骨中切取透明軟骨，

6、剝?nèi)ス悄?，去除骨化部分，用生理鹽水洗凈，切成0.5mm左右的薄片，液氮冷凍粉碎后稱重，按照軟骨量加入5倍體積的脫脂液(氯仿∶甲醇∶水=1∶2∶0.8)在4℃下攪拌脫脂48h，期間每8h更換脫脂液直到脫脂完全，在同樣溫度和攪拌條件下用10倍體積的0.lmol/L鹽酸進(jìn)行脫鈣處理48h，直到軟骨變?nèi)彳洠x心去除脫鈣液，按照每克軟骨加入10倍體積的4mol/L鹽酸胍，于4℃攪拌48h，12000g離心20min，沉淀用Tris-HCl（pH7.4）緩沖液和0.5mol/L乙酸充分洗滌后，用5倍體積的胃蛋白酶消化液(0.5mol/L乙酸配成1g

7、/L)混懸，4℃下攪拌24h，12000g離心30min，收集上清液；沉淀再加5倍體積的胃蛋白酶消化液重復(fù)酶解一次，離心收集上清液?；旌蟽纱紊锨逡?，用5mol/LNaOH迅速調(diào)節(jié)上清液至pH7.4。加入氯化鈉（NaCl）使其濃度為3mol/L，4℃鹽析過夜，離心得到上清液和沉淀A1。調(diào)NaCl濃度至4mol/L時(shí)，4℃鹽析過夜，離心得到上清液和沉淀A2。取沉淀A1用0.1mol/L乙酸溶解，2mol/LNaOH中和至pH7.4，分別再用0.05mol/LTris-HCl(pH7.4)、蒸餾水進(jìn)行透析平衡后，即得膠原初提液S1。　　1.3

8、.2陰離子交換樹脂(DEAE32)的預(yù)處理　　DEAE-32經(jīng)過溶脹、酸處理、堿處理后，用去離子水平衡至中性，處理好的離子交換載體置于4℃冰箱冷卻備用?！　?.3.3蛋白批量離子交換　　將蛋白初提液S1和3