9 吳旭杰 大腸桿菌生長曲線測定

《9 吳旭杰 大腸桿菌生長曲線測定》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。

1、大腸桿菌生長曲線測定一、實驗簡介大多數(shù)細菌的繁殖速度很快，在合適的條件下，一定時期的大腸桿菌細胞每20min分裂一次，將一定量的細菌轉(zhuǎn)入新鮮液體培養(yǎng)基中，在適宜的條件下培養(yǎng)細胞要經(jīng)歷延遲期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期和衰亡期四個階段。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，以細菌數(shù)目的對數(shù)或生長速率為縱坐標(biāo)作圖所繪制曲線稱為該細菌的生長曲線。不同的細菌在相同的培養(yǎng)條件下其生長曲線不同，同樣的細菌在不同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)所繪制的生長曲線也不相同。測定細菌的生長曲線，了解其生長繁殖規(guī)律，這對人們根據(jù)不同的需要，有效地利用和控制細菌的生長具有重要意義。本實驗用分光光度計進行光電

2、比濁測定。當(dāng)光線通過微生物菌懸液時，由于菌體的散射及吸收作用使光線的透過率降低，在一定的范圍內(nèi)，微生物細胞濃度與透光度成反比，與光密度成（OD值）正比。因此可利用分光光度計測定菌懸液的光密度來推知菌液濃度，并將所測的OD值與其對應(yīng)的培養(yǎng)時間作圖，即可繪制出該菌在一定條件的生長曲線。二、實驗試劑與材料1、菌種：大腸桿菌2、培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基（蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化鈉10g、PH7.0～7.2）70ml，分裝2支大試管（5ml/支），剩余60ml裝入250ml三角燒瓶中進行滅菌。3、儀器及器具：分光光度計、比色杯、水浴恒溫搖床、接種環(huán)、無

3、菌吸管、三角瓶、無菌水、無菌操作臺、酒精燈。三、實驗過程和步驟1、種子液制備：在無菌操作臺上用滅菌的接種環(huán)以無菌操作挑取大腸桿菌菌種放入滅過菌的無菌三角燒瓶中，并用無菌水稀釋50倍。放在無菌條件下靜置一段時間作種子懸液。注：挑取菌落時必須對大腸桿菌菌落的形態(tài)特點進行深入了解以便挑取同一菌落菌種，從而避免對后面的比濁產(chǎn)生影響。2、大腸桿菌形態(tài)學(xué)觀察：取菌懸液將其涂布在1cm^2的載玻片的面積上自然烘干，然后進行革蘭氏染色（涂片—晾干—固定—結(jié)晶紫染色—水洗—媒染—水洗—脫色—復(fù)染—水洗—曬干—鏡檢），對其進行形態(tài)學(xué)觀察。3、接種培養(yǎng)：用無菌吸管

4、取1ml菌懸液加入到經(jīng)滅菌24h靜置后無雜菌感染的LB培養(yǎng)基的錐形瓶中，混勻，此時記為0h，在37攝氏度水浴恒溫搖床上培養(yǎng)。注：所用LB培養(yǎng)基必須經(jīng)滅菌后在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，觀察培養(yǎng)基是否染菌。接種時必須在無菌操作臺上進行4、生長量測定：將未接種的LB培養(yǎng)基傾倒入比色杯中，選用600nm波長分光光度計上調(diào)節(jié)零點，作為空白對照。并對不同時間培養(yǎng)液從0h起依次測定1.5h、2.5h、3.5h、4.5h、5.5h、6.5h、7.5h、8.5h的OD值。注：對濃度大的菌懸液測定時須將其用無菌水稀釋一定倍數(shù)后測定，使其OD值在0.1～0.3以內(nèi)，經(jīng)稀

5、釋后測定得到的OD值要乘以稀釋倍數(shù)，才是培養(yǎng)液實際的OD值。實驗時必須嚴格控制培養(yǎng)時間。本操作步驟也可用簡便的方法代替：1．用1ml無菌吸管取0.25ml大腸桿菌過夜培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入盛有3~5mlLB液的試管中、混勻后將試管直接插入分光光度計的比色糟中，比色糟上方用自制的暗盒將試管及比色暗室全部罩上，形成一個大的暗環(huán)境，另以1支盛有LB液但沒有接種的試管調(diào)零點，測定樣品中培養(yǎng)0h的OD值。測定完畢后，取出試管置37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)。2．分別在培養(yǎng)0、1.5、2.5、3.5、4.5、6.5、7.5、8.5時，取出培養(yǎng)物按上述方法測定OD值。該方法準確度

6、高、操作簡便。但須注意的是使用的2支試管要很干凈，其透光程度愈接近，測定的準確度愈高。四、實驗分析與檢測1、形態(tài)學(xué)特點：大腸桿菌革蘭氏陰性短桿菌，大小0.5×1～3微米。周身鞭毛能運動，無芽孢。在普通瓊脂培養(yǎng)基上面都是一樣的,圓形邊緣整齊，表面光滑，半透明，小凸起典型的大腸桿菌在伊紅美藍瓊脂平板上的特征為：深紫黑色、光滑、濕潤、帶有金屬光澤的圓形菌落。2、測定的OD值培養(yǎng)時間/h01.52.53.54.56.57.58.5OD值0.2700.6330.6851.0301.2201.2151.2151.1553、繪制大腸桿菌生長曲線將每一種一定

7、量的細菌轉(zhuǎn)入新鮮液體培養(yǎng)基中，在適宜的條件下培養(yǎng)細胞要經(jīng)歷延遲期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期和衰亡期四個階段。延遲期：又叫調(diào)整期。細菌接種至培養(yǎng)基后，對新環(huán)境有一個短暫適應(yīng)過程（不適應(yīng)者可因轉(zhuǎn)種而死亡）。此期曲線平坦穩(wěn)定，因為細菌繁殖極少延遲期長短因素種、接種菌量、菌齡以及營養(yǎng)物質(zhì)等不同而異，一般為1～4小時。此期中細菌體積增大，代謝活躍，為細菌的分裂增殖合成、儲備充足的酶、能量及中間代謝產(chǎn)物。對數(shù)生長期：又稱指數(shù)期。此期生長曲線上活菌數(shù)直線上升。細菌以穩(wěn)定的幾何級數(shù)極快增長，可持續(xù)幾小時至幾天不等（視培養(yǎng)條件及細菌代時而異）。此期細菌形態(tài)、染色、生

8、物活性都很典型，對外界環(huán)境因素的作用敏感，因此研究細菌性狀以此期細菌最好。抗生素作用，對該時期的細菌效果最佳。穩(wěn)定期：該期的生長菌群總數(shù)處于平坦階段，但細菌群體活力