s8實(shí)驗(yàn)八 試管苗的馴化與移栽(理論)

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1、實(shí)驗(yàn)八　試管苗的馴化與移栽（理論）一、植物種質(zhì)資源保存概念及類(lèi)型植物種質(zhì)資源保存是指利用天然或人工創(chuàng)造的適宜環(huán)境保存種質(zhì)資源，使個(gè)體中所包含的遺傳物質(zhì)保持其遺傳完整性和活力，并能通過(guò)繁殖將其遺傳特性傳遞下去。其保存類(lèi)型有兩種，即原生境保存和非原生境保存。1、原生境保存是將植物的遺傳材料保存在它們的自然環(huán)境中。原生境保存的地方多是植物保護(hù)區(qū)，是保存植物整個(gè)群落的最好方法。另一種方法為農(nóng)田種植保存，即將原生境植物種植在農(nóng)田中進(jìn)行保護(hù)。如云南水稻。2、非原生境保存是將植物的遺傳材料保存在不是它們的自然生境的地方。非原生境保存方式有植物園、種子庫(kù)、種質(zhì)圃、試管苗庫(kù)、超低溫庫(kù)等，具體保存方法

2、有四種，即種植保存、貯藏保存、離體保存和基因文庫(kù)保存。9二、種質(zhì)資源離體保存離體保存方法有低溫保存、超低溫保存和生長(zhǎng)抑制劑保存三種方法。（一）低溫保存是一種緩慢生長(zhǎng)保存方法，是通過(guò)控制培養(yǎng)溫度來(lái)限制培養(yǎng)物各種生長(zhǎng)因子的作用，使培養(yǎng)物生長(zhǎng)減少到最低限度。低溫保存的基本特征是保存材料的定期繼代培養(yǎng)，不斷繁殖更新；基本措施是控制保存材料所處的溫度和光照。一般，5—10℃適宜保存溫帶起源植物的試管苗，15—18℃可用于熱帶植物試管苗的保存。除了溫度的控制之外，適當(dāng)縮短光照時(shí)間，降低光照強(qiáng)度，也能減緩材料的生長(zhǎng)速度，延長(zhǎng)保存時(shí)間。延緩保存材料生長(zhǎng)速度的另一項(xiàng)措施是改變培養(yǎng)基的成分。種質(zhì)庫(kù)要定

3、期檢查，保持清潔，及時(shí)清除污染材料，并注意積累資料。9（二）超低溫保存也叫冷凍保存，一般以液N2為冷源，使保存溫度維持在-196℃。1、保存原理低溫冰凍過(guò)程中，如果生物細(xì)胞內(nèi)水分結(jié)冰，細(xì)胞結(jié)構(gòu)就遭到不可逆的破壞，導(dǎo)致細(xì)胞和組織死亡。植物材料在超低溫條件下之所以可以長(zhǎng)期保存并能在離開(kāi)保存環(huán)境后正常進(jìn)行細(xì)胞分裂和分化就是在冰凍過(guò)程中避免了細(xì)胞內(nèi)水分結(jié)冰，并且在解凍過(guò)程中防止細(xì)胞內(nèi)水分次生結(jié)冰而達(dá)到植物材料保存目的。植物細(xì)胞含水量大，冰凍保存難度大，投放液N2中易引起組織和細(xì)胞死亡，故須借助于冷凍防護(hù)劑，防止細(xì)胞冰凍或解凍時(shí)引起過(guò)度脫水而遭到破壞，保護(hù)細(xì)胞。2、基本程序超低溫保存的基本程

4、序包括預(yù)處理、冷凍處理、冷凍貯存、解凍和再培養(yǎng)。9（1）預(yù)處理為了保證莖尖在液N2處理后具有穩(wěn)定且高的存活率，需進(jìn)行一定的預(yù)處理，或在冷凍防護(hù)劑存在下進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，或直接進(jìn)行低溫（-3—10℃）預(yù)處理。（2）冷凍處理冷凍處理的方法有快速冷凍法、慢速冷凍法、預(yù)冷凍法和干燥冷凍法。a、快速冷凍法是指將植物材料從0℃或者其他預(yù)處理溫度直接投入液氮中保存的方法，降溫速度為1000℃/min。采用該法要求細(xì)胞體積小、細(xì)胞質(zhì)濃厚、含水量低、液泡化程度低的材料。b、慢速冷凍法是將處于0℃或其他預(yù)處理溫度的材料以1—2℃/min的降溫速度從起始溫度降到-100℃，穩(wěn)定1h后，投入到液氮保存或以此降溫

5、速度連續(xù)降溫至-196℃9的方法。適宜保存的材料有成熟的、含有大液泡和含水量高的細(xì)胞，對(duì)于保存在懸浮培養(yǎng)中的細(xì)胞特別有效。c、預(yù)冷凍法是指將植物保存材料放入液氮前，需經(jīng)過(guò)短暫時(shí)間的低溫鍛煉的方法。可分為兩步冷凍法和逐級(jí)冷凍法。該方法可以使保存材料細(xì)胞內(nèi)充分脫水，避免因細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰而導(dǎo)致不可逆?zhèn)Φ某霈F(xiàn)。d、干燥冷凍法是將材料置于27—29℃烘箱內(nèi)降低植物含水量，再投入液氮中保存的方法?？煞乐共牧蟽鏊馈＃?）冷凍貯存適宜溫度下貯存冷凍材料也很重要。長(zhǎng)期內(nèi)貯存在液氮內(nèi)的材料，需合適的液氮容器。冷凍貯存的莖尖隨保存時(shí)間的延長(zhǎng)，其生活力可能下降。（4）解凍9植物材料在超低溫貯存過(guò)程中所發(fā)生的

6、凍害是在冷凍和解凍過(guò)程中產(chǎn)生的。解凍過(guò)程中發(fā)生的凍害是由細(xì)胞內(nèi)次生結(jié)冰造成的，另外，解凍過(guò)程中水的滲透沖擊也會(huì)對(duì)細(xì)胞膜體系造成破壞。解凍方法有快速解凍和慢速解凍兩種。a、快速解凍法是指將液氮中保存的材料直接投入到37—40℃溫水浴中進(jìn)行解凍的方法。解凍的升溫速度為500—750℃/min，大多數(shù)植物材料可采用此種方法。b、慢速解凍法是將液氮中保存的材料先置于0℃低溫下解凍，再逐漸升至室溫下進(jìn)行解凍的方法。適宜細(xì)胞含水量較低的材料。如木本植物的冬芽。（5）再培養(yǎng)9是指將已解凍的材料重新置于培養(yǎng)基上使其恢復(fù)生長(zhǎng)的過(guò)程。再培養(yǎng)是檢驗(yàn)冷凍保存效果或確定保存方法是否合適的最根本方法。3、影響

7、因素材料超低溫保存時(shí)，除了預(yù)處理、冷凍、解凍方法對(duì)植物材料冷凍保存效果有重要影響外，植物材料的性質(zhì)和冷凍保護(hù)劑的使用對(duì)其也有很大的影響。所使用的冷凍保護(hù)劑應(yīng)具有以下特性：分子質(zhì)量較小、易于與溶劑混合、快速滲入細(xì)胞、無(wú)毒或毒性小、易洗脫。常用的是DMSO。4、超低溫保存后細(xì)胞或組織活力檢測(cè)◆根本方法是再培養(yǎng)◆染色法：FDA、伊凡藍(lán)法、TTC等（三）生長(zhǎng)抑制劑保存主要包括高滲保存法、生長(zhǎng)抑制劑保存法、饑餓法、礦物油覆蓋法、低光照培養(yǎng)法及低壓保存法。91、高滲保存法利用培養(yǎng)