高產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選

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1、高產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選一：前言1.掌握從環(huán)境中采集樣品并從中分離純化某種微生物的完整操作步驟。2.鞏固以前所學(xué)的微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。3.學(xué)會(huì)篩選高產(chǎn)淀粉酶菌株。關(guān)鍵詞：產(chǎn)淀粉酶、芽孢桿菌、酶活力、篩選1.α-淀粉酶是一種液化型淀粉酶，它的產(chǎn)生菌芽孢桿菌，廣泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉類物質(zhì)的土壤等樣品中。2.從自然界篩選菌種的具體做法，大致可以分成以下四個(gè)步驟：采樣、富集培養(yǎng)、初步篩選、分離純化和性能測(cè)定。a)采樣：即采集含菌種的樣品采集含菌樣品前應(yīng)調(diào)查研究一下自己打算篩選的微生物在哪些地方分布最多，然后才可著手做

2、各項(xiàng)具體工作。在土壤中幾乎各種微生物都可以找到，因而土壤可說(shuō)是微生物的大本營(yíng)。例如廚房土壤、面粉加工廠和菜園土壤中淀粉的分解菌較多。b)富集培養(yǎng)：富集培養(yǎng)就是在所采集的土壤等含菌樣品中加入某些物質(zhì)，并創(chuàng)造一些有利于待分離微生物生長(zhǎng)的其他條件，使能分解利用這類物質(zhì)的微生物大量繁殖，從而便于我們從其中分離到這類微生物。c)初步篩選：i.初篩使用選擇培養(yǎng)基對(duì)菌種進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)培養(yǎng)基的特殊成分，來(lái)篩選出目的菌種，從而進(jìn)行培養(yǎng)。ii.初篩利用鑒別培養(yǎng)基，通過(guò)添加一些特殊的試劑或成分來(lái)鑒別出目的菌種，從而篩選出來(lái)并對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)

3、。d)分離純化：通過(guò)上述的篩選只能說(shuō)我們要分離的目的菌種已經(jīng)存在，但還要把夾雜在其中的雜菌除去，從而得到純種的菌落。純種分離的方法很多，主要有：平板劃線分離法、稀釋分離法、單孢子或單細(xì)胞分離法、菌絲尖端切割法等。e)性能測(cè)定：分離純化得到的菌種之后，所分得的菌種是否具有實(shí)驗(yàn)所要求的性能，還必須要進(jìn)行性能測(cè)定后才能決定取舍。二、實(shí)驗(yàn)材料：接種環(huán)、試管、三角瓶、培養(yǎng)皿、移液管、高壓蒸汽滅菌鍋、玻璃棒、量筒、酒精燈、紗布、棉花、面線繩、恒溫培養(yǎng)箱載玻片可見(jiàn)分光光度計(jì)顯微鏡紫外操作臺(tái)實(shí)驗(yàn)試劑：牛肉膏、蛋白胨、淀粉、NaCl

4、、瓊脂粉、蒸餾水、盧卡式碘液、95%乙醇、蕃紅、革蘭氏碘液培養(yǎng)基配制：牛肉膏1.3g、蛋白胨2.5g、NaCl1.3g、淀粉2g、溶于250mL蒸餾水中，一邊加熱再慢慢加入5g瓊脂粉三：實(shí)驗(yàn)步驟1培養(yǎng)基的制備及其儀器的滅菌（1）按培養(yǎng)基配方比例依次準(zhǔn)確地稱取牛肉膏1.3g、蛋白胨2.5g、NaCl1.3g、淀粉2g、溶于50mL蒸餾水中，一邊加熱再慢慢加入5g瓊脂粉放入燒杯中。加水到250mL熔解,并做好標(biāo)記,再加入瓊脂加熱溶化,溶解2h，最后補(bǔ)充水到標(biāo)記處，裝入三角燒瓶?jī)?nèi)，加塞包扎。（2）試管中加入9ml水，2個(gè)

5、錐形瓶中加入150mL水，將所有待滅菌儀器和培養(yǎng)基用報(bào)紙包扎，121℃，30分鐘高壓蒸汽滅菌。（3）倒平板將滅菌的培養(yǎng)基冷至50℃左右，三角瓶中的培養(yǎng)基倒平板，并貼上標(biāo)簽，靜置待用。2產(chǎn)淀粉酶菌株的分離、純化（1）采集土壤樣本取離地面5-15cm處的土樣10g（2）稀釋稱取土樣10g，放入盛有90ml無(wú)菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，至于搖床搖1小時(shí)，使土樣和水充分混合，使細(xì)胞分散。用一只無(wú)菌吸管吸取1ml土壤懸浮液加入盛有9ml含有無(wú)菌水的試管中充分混勻，此為10-1稀釋液，依此稀釋10-2、10-3、10-4、10

6、-5、10-6幾種稀釋度的土壤溶液。（3）初步篩選用稀釋樣品的不同吸管分別依次從10-6、10-5、10-4、10-3樣品稀釋液中，吸取0.2mL于冷卻凝固的平板上，用涂布棒涂抹均勻。倒置于37℃溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)24小時(shí)后，取出平板，注入1-2ml碘液，觀察其透明圈，因淀粉遇碘變藍(lán)色，如菌落周圍有透明圈，說(shuō)明該菌能產(chǎn)生淀粉酶使其水解。從平板上選取淀粉水解圈直徑與菌落直徑之比較大的單菌落，用接種環(huán)沾取少量菌株采用四區(qū)域劃分法。（4）取長(zhǎng)勢(shì)好的菌株重復(fù)篩選3次（5）將篩選所得單菌落進(jìn)行革蘭氏染色觀察其形態(tài)涂片、

7、干燥及固定初染：在做好的涂面上滴加草酸銨結(jié)晶紫染液，染1分鐘，傾去染液，流水沖洗至無(wú)紫色。媒染：先用新配的碘液沖去殘水，而后用其覆蓋涂面1分鐘，后水洗。脫色：除去殘水后，滴加95%酒精進(jìn)行脫色約15－20秒，后立即用流水沖洗。復(fù)染：滴加番紅染色液，染1分鐘，水洗后用吸水紙吸干。鏡檢：油鏡觀察染色結(jié)果。（6）酶活力測(cè)定接種環(huán)沾取少許菌株于裝有5ml無(wú)菌水的試管中，充分振搖，倒入離心試管中，4000r/min離心30min,取3支試管，標(biāo)明BO,B及U（BO：空白管，B：對(duì)照管，U：待測(cè)管），分別加入0.4g/ml淀粉

8、緩沖液1ml，U管中加入離心所得的上清液100ul，BO管中加入蒸餾水100ul?；靹蚝蠓湃?7℃水浴箱準(zhǔn)時(shí)水浴7.5min，取出加入碘應(yīng)用液1ml搖勻，此時(shí)B管中加入上清液100ul。各管再加蒸餾水搖勻，660nm的波長(zhǎng)下測(cè)吸光度。酶活力計(jì)算：U＝（AB-AU）×80ABO（1）移液管吸取0.2ml菌懸液于12個(gè)平板上，用涂布棒涂抹均勻，分別紫外光照突變3