淀粉酶高產(chǎn)菌株篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化研究 - 副本

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1、第29卷第10期河南科學(xué)Vol.29No.102011年10月HENANSCIENCEOct.2011文章編號：1004-3918（2011）10-1185-05淀粉酶高產(chǎn)菌株篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化研究1，21，21，211權(quán)淑靜，馬煥，解復(fù)紅，謝寶恩，周伏忠（1．河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司，鄭州450008；2．河南省微生物工程重點實驗室，鄭州450008）摘要：從濟源市麥田的土壤中篩選工業(yè)生產(chǎn)上有潛在應(yīng)用價值的高產(chǎn)淀粉酶菌株，通過平板初篩和搖瓶復(fù)篩，得到高產(chǎn)淀粉酶細菌菌株P(guān)11（2）.對其產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化，最終得到最適碳源為可溶性淀粉，最適氮源為酵母粉和蛋白胨組合，加入MgSO4可

2、以促進產(chǎn)酶，加入CaCl2或FeSO4抑制產(chǎn)酶.經(jīng)正交試驗確定培養(yǎng)基的最優(yōu)組成，優(yōu)化后的培養(yǎng)基組分為：可溶性淀粉20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，磷酸氫二鉀1.2g/L，硫酸鎂0.5g/L，氯化鈉5g/L.該菌株在發(fā)酵4d時產(chǎn)酶能力最強；最適宜的發(fā)酵溫度為于37℃；最佳發(fā)酵初始pH值為8．0.優(yōu)化后的酶活是優(yōu)化前的3倍，達到183．12U/mL.關(guān)鍵詞：淀粉酶；篩選；優(yōu)化中圖分類號：TQ925+.1文獻標識碼：A淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶類總稱，能夠水解淀粉分子生成包括糊精在內(nèi)的不同水解產(chǎn)物并逐步生[1-2][3-4]成由葡萄糖單位組成的聚合物.淀粉酶被廣泛應(yīng)用于淀粉液化糖化、

3、紡織、烘焙、釀造、飼料、造紙、化工[5]等工業(yè)過程中，甚至擴展到醫(yī)藥和化學(xué)分析領(lǐng)域，是商品化生產(chǎn)最早、應(yīng)用最早、應(yīng)用范圍最廣和用量最大[6][7]的工業(yè)酶類之一，占據(jù)了酶制劑市場份額的25％~33％左右.[8]淀粉酶雖然可以來自動物或植物，但目前工業(yè)生產(chǎn)上一般都以微生物發(fā)酵法大規(guī)模生產(chǎn).雖然不少微生物能產(chǎn)生淀粉酶，但適合商業(yè)生產(chǎn)需要的菌株仍然很少，在淀粉酶生產(chǎn)過程中選擇適合的菌株是最重要的前提條件.各國在對淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選方面都做了大量的研究工作，對高產(chǎn)淀粉酶菌株的選育已成為[9]生物工程的研究熱點.本研究以在濟源市麥田采集的土壤為原料，旨在分離出高產(chǎn)淀粉酶菌株作為出發(fā)菌株，研究其產(chǎn)酶條

4、件并對發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，進一步提高其產(chǎn)酶能力，為使其最終應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)、創(chuàng)造效益打下基礎(chǔ).1材料與方法1．1材料1．1．1土樣來源濟源市麥田土壤.1．1．2培養(yǎng)基平板初篩培養(yǎng)基：可溶性淀粉15g，KNO31g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O0．5g，NaCl0．5g，F(xiàn)eSO·47H2O0．01g，H2O1000mL；pH7．2～7．4.斜面培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂粉15g/L；pH7．4.種子培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，H2O1000mL；pH7．4～7．6.基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉20g，蛋白胨10g，酵母粉

5、5g，K2HPO41g，NaCl1g，H2O1000mL；pH7．4.1．2試驗方法1．2．1菌株篩選平板初篩：將1g從麥田中采集的土樣加入內(nèi)裝100mL無菌水和12～13個已滅菌的玻璃珠的三角瓶中，振搖10min左右，充分打散土樣，梯度稀釋后取200μL樣品，涂布于初篩平板上，30℃恒溫培養(yǎng)24h.在平板上噴灑碘液，挑出水解圈直徑（D）/菌落直徑（d）比值大的菌落，進一步劃線分離后，編號并斜面保存.復(fù)篩：將初篩獲得的分離菌株接入種子培養(yǎng)基，在37℃環(huán)境下、180r/min培養(yǎng)15h，以2％接種量至種量至發(fā)酵培養(yǎng)基，相同條件下培養(yǎng)4d后測定酶活.收稿日期：2011-08-15基金項目：河南

6、省重大公益性科研項目（091100910500）作者簡介：權(quán)淑靜（1980－），女，河南洛陽人，助理研究員，碩士研究生，研究方向為生物技術(shù).-1186-河南科學(xué)第29卷第10期1．2．2酶活測定方法發(fā)酵液5000r/min離心10min，取上清液即得粗酶液.采用DNS法測定還原糖的含量，方法是將底物（1％的淀粉溶液），即將1g淀粉溶于100mL的pH7．5，Tris－HCl緩沖液中加熱使其溶解.對照組（180μL底物，加20μL緩沖液，混勻）、樣品組（180μL底物，加20μL稀釋酶液，混勻）.將樣品組、對照組均放入50℃水浴鍋中保溫10min，取出后各加200μL的DNS，沸水浴5min

7、后取出，用蒸餾水定容至2．5mL，混勻后520nm紫外光下測OD值.酶活力單位（U）定義為：50℃，pH7．5條件下每分鐘從可溶性淀粉中釋放1μmoL葡萄糖所需的酶量.1．2．3最佳碳源的確定500mL三角瓶中各裝50mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，其中的碳源分別為可溶性淀粉、玉米淀粉、葡萄糖、蔗糖、糊精、麥芽糖、乳糖；設(shè)3個重復(fù).接入種子液2mL，37℃，180r/min培養(yǎng)4d，測定粗酶液酶活.1．2．4最佳氮源的確定500mL