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《堿性蛋白酶高產(chǎn)菌株的篩選鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化.doc》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。
1、堿性蛋白酶高產(chǎn)菌株的篩選鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化摘要通過測(cè)量比較牛奶平板上透明圈的大小，從土壤中篩選出一株高產(chǎn)堿性蛋白酶的菌株BP-10，通過產(chǎn)堿性菌株生理生化試驗(yàn)，16SrDNA序列鑒定為專性嗜堿性芽孢桿菌Bacilluspseudofirmus。然后從酶活為26.34U/ml的10號(hào)菌株（BP-10）出發(fā)，確定了其最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源是蛋白胨，在培養(yǎng)36h后達(dá)到最大酶活為193.39U/ml，比優(yōu)化前提高了7.34倍。關(guān)鍵詞堿性蛋白酶篩選鑒定培養(yǎng)發(fā)酵優(yōu)化堿性蛋白酶(AlkalineProtease)是一類適宜
2、于在堿性條件下水解蛋白質(zhì)肽鍵的酶類，廣泛存在于動(dòng)、植物及微生物生物體中,在豬的胰臟中最早被發(fā)現(xiàn)【1】【2】。1945年瑞士DrJaag等人在地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)中發(fā)現(xiàn)了堿性蛋白酶【3】。堿性蛋白酶作為工業(yè)催化劑已廣泛應(yīng)用于制革、銀回收、醫(yī)藥、食品加工、飼料、化學(xué)工業(yè)、廢物處理等行業(yè),尤其是作為無磷洗衣粉的添加劑應(yīng)用廣泛【4】，目前堿性蛋白酶的銷售量大約占全世界每年總銷售量的30%左右【5】。但洗滌劑用堿性蛋白酶要求其在廣泛的pH和溫度圍保持較高的酶活力和穩(wěn)定性,同時(shí)還必須與含
3、有多種氧化劑、鰲合劑和表面活性劑的洗衣粉相融合。目前,在工業(yè)應(yīng)用中的很多堿性蛋白酶存在弊端,例如在表面活性劑、氧化劑、熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性方面及培養(yǎng)基成本較高等【6】【7】。因此,篩選新的高產(chǎn)堿性蛋白酶菌株和對(duì)其產(chǎn)堿性蛋白酶的酶學(xué)條件研究具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)利用基因工程手段進(jìn)行改造將是以后研究的重點(diǎn)方向。本實(shí)驗(yàn)從土壤中篩選出若干產(chǎn)堿性蛋白酶的菌株并摸索了其酶學(xué)性質(zhì)及產(chǎn)酶的最始條件，為后期改造菌種提供了基礎(chǔ)。1材料與方法1.1材料1.1.1土樣來源工業(yè)大學(xué)的花園、樹林1.1.2培養(yǎng)基【8】牛奶培養(yǎng)基：
4、酵母粉0.5g、瓊脂粉2g、脫脂奶2g及0.1mol/LNa2CO3-NaHCO3緩沖液pH10.0、蒸餾水100ml。種子培養(yǎng)基：酵母粉0.5g、胰蛋白胨0.5g、葡萄糖1g、K2HPO41.8g、水100ml?；景l(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖1.00g、酵母粉1.00g、K2HPO40.1g、干酪素0.10g、氯化鈉1.00g及0.1mol/LNa2CO3-NaHCO3緩沖液(pH10)100ml溶解。以上培養(yǎng)基均在121℃下滅菌20min1.1.3主要試劑干酪素、三氯乙酸、酪氨酸、福林試劑、硼砂、葡萄糖、酵母粉、胰蛋
5、白胨及其他試劑均為市售分析純；所用到的分子試劑均購于生工生物工程。1.2方法1.2.1產(chǎn)堿性蛋白酶菌株的篩選初篩稱土樣l0g于裝有90mL無菌水的三角瓶，振蕩，靜置，吸取0.1ml菌懸液于另一個(gè)裝有0.9ml無菌水的1.5ml的離心管，振蕩均勻，既得10-1的稀釋液，然后以此方法繼續(xù)稀釋得到10-2、10-3的稀釋液。吸取0.2ml稀釋菌液（10-1、10-2、10-3）涂布于牛奶平板培養(yǎng)基中，30℃恒溫培養(yǎng)24h~48h后，根據(jù)透明圈的有無，挑取透明圈直徑較大的菌落，進(jìn)行分離純化、斜面保藏。復(fù)篩將初篩的菌株經(jīng)斜
6、面活化后接種于種子培養(yǎng)基中，30℃、200rpm培養(yǎng)12h，按2%的接種量接入50mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、200rpm培養(yǎng)48h，10000rpm離心5min，取上清液測(cè)定蛋白酶活力。1.2.2堿性蛋白酶活力測(cè)定按輕工業(yè)部頒標(biāo)準(zhǔn)QB/T3-93：Folin試劑顯色法【9】。規(guī)定將lml酶液在40℃、pH10.5，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生lμg酪氨酸所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位（U/ml）。1.2.3菌株16SrDNA序列鑒定菌株16SrDNA序列由生工公司測(cè)序。使用細(xì)菌基因組DNA小量純化試劑盒提取細(xì)菌基因組DN
7、A，PCR所用引物為：16S-F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'16S-R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。50μLPCR反應(yīng)體系：2×TaqMasterMix25μL，上下游引物各2μL，模板DNA1μL，無菌去離子水補(bǔ)充至50μl；程序：95℃，5min；95℃，30s；50℃，30s；72℃，2min；72℃，10min；30個(gè)反應(yīng)循環(huán)。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠回收測(cè)序。登錄GenBank數(shù)據(jù)庫，同相關(guān)菌株比對(duì)，確定篩選出的菌種。1.2.4不同碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響
8、分別配制四種用蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、淀粉作為唯一碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基（pH10），其他條件保持一致，將四種培養(yǎng)基滅菌，37°C搖床培養(yǎng)24h，測(cè)定酶活,選定最佳碳源。1.2.5不同氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響分別配制五種用牛肉膏、蛋白胨、豆餅粉、尿素、硫氨酸作唯一氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基（pH10），選用測(cè)定上一組最高酶活的碳源作為唯一碳源，其他條件保持一致，37°C搖床培養(yǎng)24h，測(cè)定酶活，選
