引物設(shè)計(jì)總結(jié)word

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1、引物設(shè)計(jì)總結(jié)寡核苷酸的優(yōu)化設(shè)計(jì)鄭仲承(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究所，上海200031)在核酸分子雜交、DNA序列測(cè)定和通過(guò)PCR放大DNA片段等實(shí)驗(yàn)中，都需要使用寡核苷酸作為探針或引物，而對(duì)這些反應(yīng)的質(zhì)量起最重要影響作用的，就是這些寡核苷酸探針或引物。用優(yōu)化的寡核苷酸進(jìn)行實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚝芸斓玫胶玫慕Y(jié)果，而用不夠合適的寡核苷酸時(shí)，常常得出似是而非的結(jié)果，不僅大大增加了后續(xù)實(shí)驗(yàn)的工作量，還可能一無(wú)所獲。怎樣優(yōu)化設(shè)計(jì)寡核苷酸呢?至少有下列幾個(gè)方面的問(wèn)題需要考慮。1.估測(cè)可能形成的DNA或RNA雙鏈的穩(wěn)定性

2、寡核苷酸，無(wú)論是DNA的或者RNA的，都有形成雙鏈結(jié)構(gòu)的潛在可能性，正如下面反復(fù)提到的，這種結(jié)構(gòu)對(duì)寡核苷酸的作用有很大影響。所以，預(yù)測(cè)這種結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性對(duì)設(shè)計(jì)和優(yōu)化寡核苷酸就很重要。在一個(gè)雙鏈結(jié)構(gòu)中，堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性是由其鄰近堿基決定的。在熱動(dòng)力學(xué)中，這樣的性質(zhì)以雙鏈形成時(shí)的自由能(ΔG)來(lái)表示。現(xiàn)在，大多采用Breslauer等人提出的，以最接近的相鄰核苷酸的動(dòng)力學(xué)數(shù)值(自由能)來(lái)預(yù)測(cè)雙鏈穩(wěn)定性的方法。為簡(jiǎn)化起見，所有的計(jì)算都在25℃條件下進(jìn)行。此時(shí)，最接近的相鄰核苷酸的自由能是：此主題相關(guān)圖片如下：ΔG(kca

3、l/mol)例如，雙鏈d(ACGG／CCGT)的ΔG是：ΔG(ACGG)＝ΔG(AC)＋ΔG(CG)＋ΔG(GG)＝－(1.3＋3.6＋3.1)＝－8.0kcal/mol此計(jì)算方法特別適用于測(cè)定其3′末端會(huì)形成雙鏈的引物的相容性。也可以用來(lái)計(jì)算發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的ΔG。不過(guò)，這時(shí)需要根據(jù)環(huán)區(qū)內(nèi)核苷酸的數(shù)量添加一定的數(shù)值。如3個(gè)核苷酸時(shí)為5.2kcal/mol；4個(gè)時(shí)為4.5；5個(gè)為4.4；6個(gè)是4.3；7和8個(gè)為4.1kcal／mo1。2.選擇引物的一般規(guī)則設(shè)計(jì)和選擇引物時(shí)有5個(gè)要素必需注意。2.1引物的3′末端不互補(bǔ)引物

4、的3′末端一定不能有很大的互補(bǔ)性，因?yàn)樗鼈兊幕パa(bǔ)會(huì)形成引物二聚體，這就會(huì)帶來(lái)很大的問(wèn)題，例如合成出非專一的產(chǎn)物，極大地減少所期望產(chǎn)物的得量。有實(shí)驗(yàn)表明，3′末端雙鏈的ΔG是0～－2kcal/mol時(shí)，PCR產(chǎn)量幾乎達(dá)到百分之百，隨著其絕對(duì)值的增加產(chǎn)量逐漸下降，在－6時(shí)只有40%，到－8時(shí)少于20%，而－10時(shí)，接近于0。雖然產(chǎn)量還取決于其他參數(shù)，如退火溫度、引物的專一性等等，但是用Taq聚合酶操作時(shí)，由于它的工作能力很強(qiáng)，能夠在很短的時(shí)間內(nèi)就識(shí)別3′末端互補(bǔ)的雙鏈區(qū)并發(fā)動(dòng)聚合反應(yīng)，即使3′末端雙鏈的穩(wěn)定性很差也不能

5、阻礙它的作用，所以這時(shí)產(chǎn)量對(duì)二聚體的形成就有很大的依賴性。2.2引物分子內(nèi)不互補(bǔ)應(yīng)當(dāng)盡量不用會(huì)通過(guò)釋放能量而形成分子內(nèi)雙鏈結(jié)構(gòu)的寡核苷酸。雖然有些帶有發(fā)夾環(huán)，其ΔG為－3kcal/mol的自身互補(bǔ)引物也可以得到不錯(cuò)的結(jié)果，但是如果它的3′末端被發(fā)夾環(huán)占據(jù)時(shí)就很麻煩，即會(huì)引發(fā)引物內(nèi)部的延伸反應(yīng)，減少了參與正式反應(yīng)引物的數(shù)量。當(dāng)然，如果發(fā)夾環(huán)在5′末端對(duì)反應(yīng)就沒有多大的影響了。2.3引物的組分、解鏈溫度和長(zhǎng)度11普遍認(rèn)為PCR引物應(yīng)當(dāng)有50%的GC/AT比率。其實(shí)，這是不對(duì)的。以人基因組DNA為模板，用81%AT的引物

6、可以產(chǎn)生單一的，專一的，長(zhǎng)250bp，含有70%AT的產(chǎn)物。完全沒有必要復(fù)雜地去計(jì)算產(chǎn)物和引物的解鏈溫度，PCR引物的GC/AT比率應(yīng)當(dāng)?shù)扔诨蚋哂谒糯蟮哪０宓腉C/AT比。要知道，更重要的因素是模板與穩(wěn)定性較小的引物之間解鏈溫度的差異。差異越小，PCR的效率越高。因?yàn)镈NA的解鏈溫度也取決于它的長(zhǎng)度，所以有的研究者喜歡設(shè)計(jì)很長(zhǎng)，而不求它很穩(wěn)定的引物。可是，引物太長(zhǎng)就難以避免形成二聚體和自身互補(bǔ)，因此，一般還是不用為好。如果期待的產(chǎn)物長(zhǎng)度等于或小于500bp，選用短的(16～18mer)的引物：若產(chǎn)物長(zhǎng)5kb，則

7、用24mer的引物。有人用20～23mer引物得到40kb的產(chǎn)物。但是，引物較長(zhǎng)時(shí)，如果不借助引物選擇的計(jì)算機(jī)軟件幫助，就很難確定一對(duì)引物是否會(huì)形成二聚體，是否有自身互補(bǔ)性以及專一性如何。于是，用眼睛選出來(lái)的寡核苷酸放大長(zhǎng)片段DNA時(shí)就會(huì)使引物彼此引發(fā)而不是延伸模板，得出非專一產(chǎn)物。通過(guò)下述的觀察內(nèi)部穩(wěn)定性原理可以極大地減少這種問(wèn)題。2.4引物的內(nèi)部穩(wěn)定性在DNA測(cè)序和PCR中最好用5′末端穩(wěn)定(如GC含量較多)，而3′末端不太穩(wěn)定(如AT含量較多)的引物，這種引物的結(jié)構(gòu)可以有效地消除假引發(fā)反應(yīng)。這就是基于引物內(nèi)部

8、穩(wěn)定性的經(jīng)驗(yàn)之談。其3′末端穩(wěn)定性低的引物在這些反應(yīng)中能起好作用的原因在于，接近或在3′末端上的堿基與非靶位點(diǎn)堿基所形成的配對(duì)的穩(wěn)定程度還不足以引發(fā)DNA合成，所以不會(huì)產(chǎn)生假產(chǎn)物。因此，為了有效地引發(fā)反應(yīng)，引物的5′末端和中央部分必須與靶DNA也形成雙鏈。與此相反，帶有穩(wěn)定的、GC豐富的3′末端的寡核苷酸不需要其所有的核苷酸序列都與靶序列配對(duì)，只憑借其3′末